Microalgae growth in anaerobic digestate for high-value product recovery

Abstract

As a result of diminished fossil fuel reserves and increased prices of petrochemical fuels, and the simultaneous result of fossil fuels on extreme greenhouse gas emissions leading global warming, the world is searching for an alternative renewable energy sources. Renewable energy sources such as solar, wind, hydro, geothermal and biomass have been successfully developed but research shows that biomass energy has the highest capability among other renewable sources. Microalgae has the highest attention in the field of bioenergy by not requiring arable land, their higher productivity and higher biofuel yield compared to terrestrial plants. Not only for bioenergy aspect, bu also for the environmental aspect, microalgae has too many advantages such as mitigation of CO2 through photosynthesis and treatment of wastewater. Anaerobic digestion is another and the most conventional methods used to generate energy from renewable sources. However, untreated anaerobic liquid digestate may cause eutrophication if directly discharges into the water sources due to its high nutrient content. Cultivating microalgae in digested effluents offers significant advantages in terms of wastewater treatment, the production of valuable biomass which can be further valorized, and a major decrease in the upstream cost of the process. Microalgae can assimilate nutrients especially nitrogen and phosphorous from wastewater for their growth and produce valuable biomass. Digestates include all essential macro/micro nutrients and can be recovered as cultivation media for microalgal biomass production. However, some of the main physicochemical characteristics of the digestates, such as high content of inhibitory compounds, turbidity, and colored dissolved compounds might negatively influence microalgal growth, and therefore they need to be adjusted by using one or a combination of pretreating methods (e.g., dilution, solid/ liquid separation, filtration, etc.) in order to provide suitable medium for cell growth. The main objective of this thesis was to investigate the applicability of recovery of nutrients from digestate with mixed microalgae and observe positive effect on algal biomass resulting in enhanced high value product content. High-value products such as pigments, proteins, lipids, and carbohydrates that are obtained from microalgae grown in digestate can used as fuel, fertilizer and animal feed contributing to a substantial saving in the overall cost of microalgae biomass production. In this scope, the Anaerobic Liquid Digestate (ALD) obtained from real full scale plant to demonstrate and to show the applicability of succesful growth on digestate, instead of treating with advanced treatment methods and to recover high value products from the wild type algal biomass isolated from near-by water bodies in ITU to examine its dominancy change and positive effect. To promote the sustainability of microalgae–bacteria-based systems that treat wastewater, the examination of multiple products in the form of high value products and biomass were detailly monitored. In the first part of the study, batch experiments were carried out to investigate the biokinetic coefficients for nutrient removal of mixed microalgae grown on anaerobic liquid digestate by Michaelis–Menten rate expression. The initial NH3-N concentration was varied between 18.6–87.1 mg L-1 while initial PO4-P concentration was between 1.85–6.88 mg L-1, which corresponds to 2%, 5%, 7% and 10% dilution ratio of anaerobic digestate. According to the yield results (mg chl a mg-1 nutrient), mixed microalgae uptake 10 times more nitrogen than phosphorus. Biokinetic coefficients were determined as kN = 2.48 mg NH3-N mg−1 chl a d−1, KmN = 29.3 mg L-1, YN = 0.45 mg chl a mg-1 NH3-N for nitrogen; and kP = 0.21 mg PO4-P mg−1 chl a d−1, KmP = 2.94 mg L-1, YP = 5.03 mg chl a mg−1 PO4-P for phosphorus. The highest chlorophyll production (39 mg L-1 or 3.31 mg L-1 d-1 ) was observed at the highest dilution ratio of 10%. Moreover, the highest dilution resulted in highest biomass (1.25 g L-1) despite of dark, high ammonicial and particulate rich wastewater. In the second stage of the study, mixed microalgal culture dominated by Chlorella vulgaris and Scenedesmus armatus were grown in Anaerobic Liquid Digestate (ALD) under different NaCl concentrations ranging between 0 to 100 mM. Highest lipid and carbohydrate amount were observed as 38% and 36%, respectively, when the salinity was 50 mM NaCl. However, the protein content was drastically decreased to 13% with increased NaCl concentration. Furthermore, the algal biomass was subsequently decreased along with total chlorophyll amount with increased NaCl concentration. Algal species showed diverse response to salinity stress and demonstrated a cost-effective approach towards the cultivation of mixed microalgae within digestate and provided insight that ALD and/or other wastewaters can be diluted with seawater instead of tap water in the future studies. This study could be further converted into biofuels due to high lipid increase along with the digestate treatment, which will help to valorize ALD and bring into economy. In the third stage of the study, FeSO4 supplementation ranging from 0 to 4.5 mM, and MgSO4 supplementation ranging from 0 to 5.1 mM were investigated to observe the effect on the population dynamics, biochemical composition and fatty acid content of mixed microalgae grown in Anaerobic Liquid Digestate (ALD). Overall, 3.1 mM FeSO4 addition into ALD increased the total protein content 60% and led to highest biomass (1.56 g L-1) and chlorophyll-a amount (18.7 mg L-1) produced. Meanwhile, 0.4 mM MgSO4 addition increased the total carotenoid amount 2.2 folds and slightly increased the biomass amount. According to the microbial community analysis, Diphylleia rotans, Synechocystis PCC-6803 and Chlorella sorokiniana were identified as mostly detected species after confirmation with 4 different markers. The abundance of Chlorella sorokiniana and Synechocystis PCC-6803 increased almost 2 folds both in iron and magnesium addition. On the other hand, the dominancy of Diphylleia rotans was not affected by iron addition while drastically decreased (95%) with magnesium addition. This study helps to understand how the dynamics of symbiotic life changes if macro elements are added to the ALD and reveal that microalgae can adapt to adverse environmental conditions by fostering the diversity with a positive effect on high value product. In conclusion, in this thesis, the production of microalgae biomass have been successfully carried out, and the macronutrients needed in the production of microalgae have been provided from the digestate effluent obtained from a real-scale anaerobic digester using a mixture of domestic organic solid waste, industrial treatment sludge and animal feces. Moreover, it helped to understand how the dynamics of symbiotic life changes if macro elements are added to the ALD and reveal that microalgae can adapt to adverse environmental conditions by fostering the diversity with a positive effect on high value product. This thesis might help to be a answer for aiming both reducing adverse effect of anaerobic liquid digestate by mixed microalgae and increasing product values by valorization and give an idea that digestate can be diluted with sea water instead of tap water in the future studies. Moreover, by this thesis, it was proves that digestate cultivated algae are rich source of primary (carbohydrates, proteins, lipids) and secondary (pigments) metabolites that could be exploited to produce biofuels, bio-polymers, biofertilizers, nutraceuticals, food/health grade compounds, enzymes, feed supplements etc. and the treated digestate can be reutilized for the agricultural or industrial purposes according to the high removal rates by mixed culture.

Dünya nüfusunun ve bağlantılı olarak ihtiyaçlarının giderek artması sonucunda hızla gelişen endüstrileşme son yüzyılda ciddi bir enerji açığı yaratmıştır. Özellikle son yıllarda ihtiyaç duyulan bu enerjinin karşılanması için fosil yakıt kullanımının hızla arttığı ve bunun da yüksek miktarda sera gazı salınımına yol açtığı bilinen bir gerçektir. Bu konuda yapılan araştırmalar sera gazlarının küresel ısınmaya ve iklim değişikliğine yol açtığını ortaya koymaktadır. Ekolojik dengenin bozulmasıyla sonuçlanacağı bilinen etkileri görülmekte olan bu olumsuzluklar bilimsel araştırmaların yönünü alternatif çevreci enerji arayışına çevirmiştir. Son yıllarda ağırlık verilen araştırma konularından biri de biyokütle ve çeşitli biyokütle kaynaklarından elde edilebilen biyoyakıtlardır. Biyokütle enerjisi, petrol ve kömür gibi güneş enerjisinin kimyasal bağlarda depolanmış halidir. Fotosentez yapan canlılar su, CO2 ve makronutrientler kullanarak; inorganik maddeden organik maddeler sentezlerken güneş enerjisini biyokütlelerini meydana getiren bileşiklerdeki kimyasal bağ enerjisine dönüştürürler. Bu biyokütlelerin doğrudan ya da depolanmış bu enerjiden maksimum verim elde etmek amacıyla biyoyakıt olarak tanımlanan biyodizel, biyoetanol ve biyogaz gibi çeşitli bileşenlere dönüştürülerek kullanılması mümkündür. Bu biyokütlelerden elde edilen enerji; yenilenebilir enerji kaynakları olarak sınıflandırılmaktadır. Biyokütle enerjisi karasal bitkilerden elde edilebileceği gibi sucul bitkilerden de elde edilebilmekle beraber son yıllarda yapılan araştırmalar mikroalg üretiminin karasal bitkilerle karşılaştırıldığında birçok yönden avantajlı olduğunu ortaya koymaktadır. Mikroalg biyokütlesinin biyoyakıt elde etmek amacıyla üretimi, temiz su gerektirmemesi, düşük karasal alan ihtiyacı, yakma gazı ve atıksu kullanımı imkânı ile dikkat çekmiştir. Anaerobik çürütme, yenilenebilir kaynaklardan enerji üretmek için kullanılan en yaygın yöntemlerden biridir. Çürütme sonucu oluşan biyogaz, gelişmiş ülkelerde büyük ölçekte ısı ve güç üretmek için kullanılırken, gelişmekte olan ülkelerde mevcut hayvan gübresi yönetimindeki sorunları çözmek ve ısıtma amaçlı kullanılmaktadır. Bu yöntem, sera gazı emisyonlarının özellikle metan gazı salınımının azaltılmasına yardımcı olurken, toprak iyileştirme özelliği yüksek olan çürütücü çıkış atığının, tarımda kullanılabilmesi gibi faydaları da vardır. Fakat çürütücü çıkış atığının, bazı istenmeyen koku, viskozite, yüksek nem ve yüksek uçucu yağ asitleri gibi özellikleri, bitkilerde fitotoksik etki oluşturabilir. Bu nedenle arıtma yapılmadan tarımsal topraklarda uygulanması risk oluşturabilir. Ayrıca, eğer çürütücü hammaddesine ısıl işlem uygulanmazsa veya çürütücü termofilik şartlarda işletilmezse patojenler tarım arazisine uygulamada sıkıntı oluşturabilir. Anaerobik çürüme sırasında, organik azotun amonyak azotuna ve toplam fosforun da ortofosfata dönüsmesi, çürütücü çıkış suyunda yüksek konsantrasyonlarda amonyak ve fosfor bulunmasina sebep olur. Çürütücü çıkış atığı için uygulanan en yaygın yöntem, araziye doğrudan uygulanmasıdır. Çürütücü çıkış atığının doğrudan araziye uygulanması, tarımsal alanlar için gübre kullanımı (mineral ve organik madde) açısından ucuz bir yöntem olarak kabul edilmektedir. Özellikle organik madde içeriğinin yüksek olması bazı tarım arazilerinde istenen bir durumdur. Ancak, kolay ayrışabilir organik bileşikler açısından tam olarak tüketilmemiş bir çürütücü çıkış atığı da elde edilebilir. Bu durum depolama aşamasında sorunlar yaratabilir (koku emisyou, patojenlerin yeniden gelişmesi ve fitotoksisite) ve potansiyel gübre değerini kısıtlayarak toprak-bitki sistemi üzerinde olumsuz etkilere yol açabilir. Bunlar bitkiler üzerinde tohumların filizlenmesinde gecikmeler, bitki ölümleri veya büyümede gerilemeler gibi incelenmesi gereken büyük ölçeklerde zararlı etkilere yol açabilir. Tarımda çürütücü çıkışının atığı, tahıl üretiminde genelde kuzey avrupa ülkeleri, Danimarka, İsveç, İskoçya ve Almanya gibi ülkelerde kullanmaktadır. Ancak çürütücü çıkış atığının toprak düzenleyicisi veya gübre olarak kullanılması istenirse, Almanya ve İngiltere'deki çürütücü çıkış atığının uygulamasında kullanılan kalite protokolleri gibi Avrupa ve Ulusal kurallar tarafından düzenlenen kalite standartlarına uygunluğu denetlenmelidir. Mikroalglerin özellikle protein olmak üzere yüksek besin içeriklerinden dolayı insanlar tarafından kullanılmaları eski Çin'de 2000 yıl kadar önceye dayanırken, mikroalg kültürü ve üretimleri 1950'lerde başlamıştır. O yıllarda mikroalg üretimi çoğunlukla besin ve beslenme yan ürünü elde etmeyi amaçlamış olsa da yanı sıra ilaç ve kozmetik sanayinde kullanılan değerli bir takım maddeler de alglerden elde edilen ürünler arasında yer almaktadır. Mikroalgler çoğunlukla fotoototrofik olarak beslenen yani organik besinlerini güneş enerjisiyle inorganik maddelerden sentezleyen, tek hücreli mikroorganizmalar olarak tanımlanırlar. Mikroalglerin biyokütle kompozisyonları, depo maddeleri ve bu maddelerin oranlarının ortam koşullarına göre değiştiği bilinmektedir. Doğal şartlar altında fotosentez depo ürünleri karbonhidratlar olan mikroalg türlerinden birçoğunun istenmeyen stres koşullarına farklı adaptasyonlar geliştirdikleri ve depo materyallerinin kompozisyonlarının değiştiği gözlemlenmiştir. Özellikle başta N azot olmak üzere mineral eksikliği ve yüksek aydınlatma koşullarında sitoplazmik lipid granülleri halinde yağ biriktirdiği raporlanmaktadır. Hücrelerde biriktirilen yağın ayrıştırılıp biyodizele dönüşümünün mümkün olduğunun ortaya çıkmasıyla, mikroalglerden biyodizel üretimi çalışmaları hızlanmıştır. Enerji elde etme amacıyla mikroalgal biyokütlenin kullanılmasının uygulanabilir hale gelmesi için üretim maliyetinin düşürülmesi konusunda birçok bilimsel araştırma sürdürülmektedir. Maliyeti arttıran önemli parametrelerden biri de mikroalglerin azot ve fosfor ihtiyacı olduğundan besi maddesi maliyetlerinin azaltılması için bu maddelerin atıksudan karşılanması konusu oldukça dikkat çekmektedir. Mikroalaglerin atıksu arıtımı amacıyla kullanımları ilk kez 1957 yılında denenmiş olmasına karşın, bugüne kadar evsel atıksularla az sayıda pilot ölçekli çalışma gerçekleşmiştir. Bu çalışmalar ile atıksulardan alg kullanılarak besin maddesi giderimi konusunda önemli bilgiler elde edilmesine karşın halihazırda uygulamaya yönelik bir çok soru ve bilinmezlik mevcuttur. Çürütücü çıkış suyunda yetiştirilen mikroalglerden elde edilen pigmentler, proteinler, lipitler ve karbonhidratlar gibi yüksek değerli ürünler yakıt, gübre ve hayvan yemi olarak kullanılarak mikroalgal biyokütle üretiminin toplam maliyetinde önemli bir tasarruf sağlamaktadır. Bu kapsamda, gelişmiş arıtma yöntemleri ile arıtma yapmak yerine, anaerobik çürütücü çıkış suyunda başarılı büyümenin uygulanabilirliğini göstermek bu tezin başlıca hedefidir. Bu amaçla, anaerobik çürütücü çıkış suyunda yetiştirilen karışık mikroalglerin arıtma verimi ve uygulanabilirliği araştırılmış, çürütücü çıkış suyunun algal kütlede bulunan yüksek değerli ürünler üzerindeki olumlu etkisi incelenmiştir. İTÜ Ayazağa Yerleşkesinde yer alan su kütlelerinden izole edilen yabani tür mikroalgler, gerçek arıtma tesisinden elde edilen anaerobik çürütücü çıkış suyunda yetiştirilerek mikroalg-bakteri bazlı arıtım sistemlerinin sürdürülebilirliğini teşvik etmek için yüksek değerli ürünler ayrıntılı olarak gözlemlenmiştir. Bu kaspamda yapılan çalışmalar bölümler halinde aşağıda özetlenmiştir. Birinci bölümde, Michaelis-Menten denklemi kullanılarak Anaerobik Çürütücü Çıkış Suyunda (ACCS)'da büyüyen karışık mikroalglerin besin giderimi için biyokinetik katsayıları araştırması üzerine kesikli deneyler yapılmıştır. Başlangıç nütrient miktarları % 2, %5, %7 ve %10 seyreltme oranına karşılık gelecek sekilde NH3-N konsantrasyonu 18.6–87.1 mg L-1 arasında değişirken, başlangıç PO4-P konsantrasyonu 1.85–6.88 mg L-1 arasında belirlenmiştir. Verim sonuçlarına göre (mg chl a mg-1), karışık mikroalglerin azotu fosfora kıyasla 10 kat faha fazla kullandiğı bulunmuştur. Biyokinetik katsayılar nitrojen için kN = 2.48 mg NH3-N mg−1 chl a d−1, KmN = 29.3 mg L-1, YN = 0.45 mg chl a mg-1 NH3-N; ve fosfor için kP = 0.21 mg PO4-P mg − 1 chl a d − 1, KmP = 2.94 mg L-1, YP = 5.03 mg chl a mg − 1 PO4-P olarak belirlenmiştir. En yüksek klorofil miktari (39 mg L-1 veya 3.31 mg L-1 d-1) %10'luk en yüksek seyreltme oranında gözlemlenmiştir. Buna ek olarak, en yüksek biyokütle (1.25 g L-1) koyu renk, yüksek azot ve yüksek partikül miktarına rağmen en yüksek dilusyon oranı olaran 10%'da gözlemlenmiştir. İkinci bölümde, Chlorella vulgaris ve Scenedesmus armatus'un hakim olduğu karışık mikroalgal kültür, 0 ila 100 mM arasında değişen farklı NaCl konsantrasyonları altında ACCS'de büyütülmüştür. Tuzluluk 50 mM NaCl olduğunda en yüksek lipid ve karbonhidrat miktarı sırasıyla % 38 ve % 36 olarak gözlenmiştir. Bununla birlikte, artan NaCl konsantrasyonu ile protein içeriği % 13'e düşmustur. Ayrıca alg biyokütlesi toplam klorofil miktarı ile birlikte artan NaCl konsantrasyonu ile birlikte azalmıştır. Alg türleri, tuzluluk stresine çeşitli tepkiler göstermiş ve ACCS'de karışık mikroalglerin yetiştirilmesine yönelik uygun maliyetli bir yaklaşım sergilemiştir ve gelecekteki çalışmalarda ACCS ve/veya diğer atık suların musluk suyu yerine deniz suyu ile seyreltilebileceği konusunda fikir vermiştir. Bu çalışma, yüksek lipid artışı nedeniyle, ACCS'yi değerlendirmeye ve ekonomiye kazandırmaya yardımcı olacak biyoyakıtlara dönüştürülebilir sonuçlar sunmuştur. Üçüncü bölümde, ACCS'de yetiştirilen karışık mikroalglerin popülasyon dinamikleri, biyokimyasal kompozisyonu ve yağ asidi içeriği üzerindeki etkisini gözlemlemek için 0 ile 4.5 mM arasında değişen FeSO4 takviyesi ve 0 ile 5.1 mM arasında değişen MgSO4 takviyesi incelenmiştir. Genel olarak, ACCS'ye 3.1 mM FeSO4 ilavesi, toplam protein içeriğini% 60 arttırmış ve en yüksek biyokütle (1.56 g L-1) ve klorofil-a miktarı (18.7 mg L-1) gözlemlenmiştir. Buna ek olarak, 0,4 mM MgSO4 ilavesi toplam karotenoid miktarını 2,2 kat artırırken, biyokütle miktarı üzerinde etkisi olmamıştır. Mikrobiyal topluluk analizine göre, Diphylleia rotans, Synechocystis PCC-6803 ve Chlorella sorokiniana, 4 farklı primer dizinleriyle onaylandıktan sonra en çok tespit edilen türler olduğundan emin olunmuştur. Chlorella sorokiniana ve Synechocystis PCC-6803'ün miktari hem demir hem de magnezyum ilavesinde neredeyse 2 kat artmıştır. Öte yandan, Diphylleia rotans'ın baskınlığı demir ilavesinden etkilenmezken, magnezyum ilavesiyle önemli ölçüde azalmıştır (% 95). Bu çalışma, ACCS'ye makro/mikro elementler eklenirse simbiyotik yaşamın dinamiklerinin nasıl değiştiğini anlamaya yardımcı olmuş ve mikroalglerin, çeşitliliğini artırarak yüksek değerli ürün üzerinde olumlu bir etki yaratarak olumsuz çevresel koşullara uyum sağlayabileceğini ortaya çıkarmıştır. Özetle, bu tezde biyokütle üretimine yönelik mikroalg biyokütlesi üretimi konusunda çalışmalar yürütülmüş, mikroalglerin üretilmesinde ihtiyaç duyulan makronütrientlerin, evsel organik katı atık, endüstriyel arıtma çamuru ve hayvan dışkısı karışımının kullanıldığı gerçek ölçekli bir anaerobik çürütücüden elde edilen çürütücü çıkış suyundan karşılanması sağlanmıştır. Sonuçlar gelecek vaat edici olup, karışık mikroalg ile hızlı besin giderme işlemlerinin uygulanabilirliği ortaya konmuştur. Böylece, çevre kirliliğinde ana kirleticiler olarak kabul edilen azot ve fosforun alg çoğaltılmasında kullanılması ile hem çevre kirliliği azaltılmış hem de alg büyümesi için dışarıdan temin edilen gerekli besin maddelerinin kullanımı ve maliyeti ortadan kaldırılmıştır. Buna ek olarak, sıvı fermente üründe yetistirilen alglere yapılan farklı stres koşullarıyla değerli ürün miktarı arttırımı, saf kültürden bağımsız karışık kültürün de değerli ürün geri kazanımında başarıyla kullanılabilecegine dair önemli sonuçlar vermiştir. Sonuç olarak, bu çalışma ile çoklu ürün geri kazanımına sahip alg biyokütlesine dayalı entegre sürdürülebilir arıtma başarıyla sağlanmıştır.