İnsuyu Mağarasının Bakteriyel Ve Arkeal Biyoçeşitliliği

Abstract

Caves are one of the unique habitats to see interaction between rock and microbes. In the aspect of microbiological researches, caves are unique environments in order to not only the limitations on exposing to exterior environmental conditions but also the natural isolation for disturbants such as other living creatures. In these harsh environments, Proteobacteria, Actinobacteria, Chlorobi/Bacteriodetes, Chloroflexi, Deltaproteobacteria, Acidobacteria, Nitrospirae, Actinobacteria and Betaproteobacteria are the most common and diverse group of bacteria because of their adaptation ability. In this study, we conducted cultivation-independent 16S rDNA surveys on the bacterial and archaeal community of Insuyu Cave, Burdur, TURKEY. The complexity of microbial communities has been presented in samples through PCR amplification of the 16S ribosomal RNA (16S rRNA) gene sequence, high resolution melting curve (HRM) and next generation sequence (NGS) based on 16S rRNA metagenomics from a variety of cave samples to identify bacterial and archaeal community profile of Insuyu Cave. A total of nine known bacterial class were found within the context of this research (Figure 3.4). The most prevalent class is alphaproteobacteria with 89,23% of the total bacteria found grouping into four order, with the most abundant ones: rhizobiales (88,85%) and sphingomonadales (0,21%). The followings, ordered by abundancy, are actinobacteria (3,94%), bacilli (2,92%), gammaproteobacteria (1,69%) and betaproteobacteria (0,74%). Also, a total of fourteen genera from ten order were identified in this study (Figure 3.5). The most dominant is methylobacterium with 88,83%, from the class of rhizobiales (88,85%). The followings are propionibacterium (3,58%), dolosigranulum (1,69%), streptococcus (1,10%) and pseudomonas (1,13%). On the other hand, no Archaeal species has been detected at the result of NGS analysis while some archaeal nucleic acid had been marked as a result of PCR analysis. The reasons of this situation has been investigated in the section of discussion.

Mağara, yüzeyin altında, alacakaranlık bölgesinin ötesine uzanan ve insanlara açık olan herhangi bir doğal boşluk olarak tanımlanır (Ford, 2007; Northup and Lavoie, 2001; Hill and Forti 1997; Gillieson 1996). Mağaralar, çevresel koşullara, içinde geliştiği kayacın türüne veya bölgesel tektonizmanın kuvvetleri gibi jeolojik faktörlere bağlı olarak birçok çeşitte şekillendirilebilir. Hiçbiri resmen kabul edilmese de, mağaraların sınıflandırılmasında yaygın olarak kullanılan bazı kriterler, mağaranın oluşum mekanizması ve oluşumun meydana geldiği sürecin anakaya oluşumunun hangi basmağına denk geldiğidir. Speleogenesis süreci esas alınarak belirlenmiş sekiz temel doğal mağara grubu vardır. Bunlardan altısının da, "Denizel mağaralar", "Talus mağaraları", "Buzul mağaraları", "Akarsu mağaraları", "Çatlak mağaraları" ve "Ağsı mağaralar", dünyanın dört bir yanında pek çok örneği bulunurken özellikle ikisi, "Volkanik mağaralar" ve "Karstik mağaralar" olarak adlandırılanlar, dünya çapında en yaygın görülenlerdir (Palmer, 2007). Mağaralar, düşük sıcaklık, yüksek nem, daimi karanlık, organik madde girdisinin olmaması gibi bir takım çevresel koşullar sebebiyle çoğunlukla ekstrem ortamlar olarak tanımlanır. Bu ekstrem koşullar sebebiyle, habitattaki mikroorganizma popülasyonu genellikle, enerji kaynağı olarak indirgenmiş inorganik bileşikleri kullanabilen, kemolitotroflar başta olmak üzere kemoototroflar tarafından oluşturulmaktadır. Kemolitotroflar, ATP sentezi sırasında oksidasyondan faydalanmakta ve bu esnada, bir kısım mineral bileşiklerin redoks tepkimeleri ile oluşmasını sağlamaktadırlar. Ayrıca, bu mikroorganizmaların zor koşullar altında yaşayabilmesini sağlayan, örneğin yüzeye tutunmak için hücre dışına polisakarit bazlı bir madde salgılamaları gibi, bir takım metabolik faaliyetleri de bu ortamlarda mineralizasyon süreçlerini desteklemektedir. Şu ana kadar, dünyada yürütülmüş çalışmaların çoğu son yirmi yıla ait olmakla beraber, 1990 öncesinde yalnızca birkaç çalışmayla sınırlı olan bu alan son on yılda hızla popüler araştırma alanlarından biri olmuştur. Mikrobiyolojik araştırmalar açısından bakıldığında, yüzey atmosfer koşullarına ve diğer canlı türlerinin yarattığı dalgalanmalara karşı korunaklı olan mağaralar ekstrem koşullarda canlılık, mikrobiyallerin yöneldiği alternatif enerji türleri, popülasyonlar arasındaki ilişki gibi konuların incelenmesi için benzersiz ortamlardır. Mağara mikrobiyolojisi çalışmalarının çoğu, ikincil mağara birikimlerinde, yani speleotemlerde yaşayan bakteri toplulukları üzerinde yapılmıştır. Proteobakteriler, adaptasyon yetenekleri nedeniyle en yaygın ve çeşitli bakteri grubudur. Ayrıca, hipojenik mağaralarda Deltaproteobakteriler, Asidobakteriler, Nitrospiler, Aktinobakteriler ve Betaproteobakteriler baskın grup oluştururlar.Çoğunlukla popülasyon kükürt oksitleyenler, nitrit-nitrat döngüsünde rol oynayanlar, demir oksitleyenler ve hidrojen oksitleyenler üzerine yoğunlaşmaktadır. Bu çalışmada, Burdur İl merkezine yakın bir doğal karstik mağara olan İnsuyu mağarasından elde edilen speleotemlerden, bu speleotemlerin oluşumu ile ilişkili xviii olabilecek, arkea ve bakteri kolonileri izole edilmesi hedeflenmiş ve çeşitli yöntemler kullanılarak tür tespiti yapılmıştır. Deney için, alınan 18 örnekten mineralojik açıdan diğerlerinden farklı olan 11'i seçildi. DNA, üretici protokolündeki değişiklikler yapılarak PowerSoil® DNA İzolasyon Kiti (MO BIO Laboratories Inc., CA) tarafından izole edildi. İlk denemelerde, agaroz jel elektroforezi sonuçları DNA ekstraksiyonu sırasında olası bir inhibisyonu işaret ettiğinden, bunun sebebi araştırıldı ve XRF analizi ile inhibisyon faktörü Ca ++ olarak belirlendi. DNA ekstraksiyonunun verimini arttırmak için, alternatif katyonik polimer, poli-deoksiinosinik-deoksisitidik asit sodyum tuzu, kullanıldı. DNA ekstraksiyonundan sonra, her örnek agaroz jelde yürütülerek analiz edildi. Jeller, 0.5 ug / mL etidyum bromür içeren 1XTAE tamponu içerisinde % 1 (ağ / hac) agaroz kullanılarak hazırlandı. 4ul DNA örnekleri, 2x jel yükleme tamponu ile karıştırıldı. Elektroforez 10V / cm'de gerçekleştirildi ve jel, jel görüntüleme sistemi (Gel Doc, BIORAD, ABD) kullanılarak UV altında görselleştirildi. Örnekler, kullanılıncaya kadar -20 ° C'de saklandı. Mikrobiyal topluluklar, ilk önce ekstraksiyon sonrasında yorum yapabilmek için yeterli 16S rRNA geni elde edilememesi sebebiyle, amplifiye edildi. 16S rRNA genine dayalı PCR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) metodolojisi ile izlendi. Mikrobiyal rDNA'ları çoğaltmak için Nested PCR yaklaşımı kullanıldı. Daha sonra, PCR ürünleri, 1X TAE tamponu (40 mM Tris bazı, 20 mM asetik asit, 1 mM 0.5 M etilendiamintetraasetik asit, pH 8.0) içinde etidyum bromür ile boyandıktan sonra% 1,5 agaroz jel üzerinde ayrıldı. AGE 100 V cm-1'de 30 dakika süreyle gerçekleştirildi ve ürünler trans-UV (BIORAD, USA) kullanılarak izlendi. Bu işlem sonucunda bakteriyel ve arkeal 16S rRNA genlerinin tüm örneklerde mevcut olduğunu doğrulandı. Ardından mağara tortullarındaki arkeal ve bakteriyel çeşitlilik, HRM kullanarak ışıma grafiklerindeki benzerliklere göre karşılaştırılarak incelendi. Mikrobiyal rDNA'ları çoğaltmak için Nested qPCR yaklaşımı kullanılmıştır (Kolukırık ve diğerleri, 2011). HRM analizi sonuçlarından yola çıkılarak, mikrobiyal topluluk profili ile örneklerin HRM profilleri arasındaki benzerlikler koröle edilerek dendrogram grafiği çizildi. Bu grafiğe göre, 11 numuneden, mağara ekosistemindeki farklı toplulukların her birini temsil etmesi açısından birbirlerine benzerlik açısından ortalama bir değer gösteren 7'si, 16S rRNA Metagenomik Dizilim için seçildi. Ardından, seçilen I3, I6, I13, I16, I17 ve I18 örnekleri, 16S rRNA Metagenomik'e dayalı gen dizileme yöntemi ile analiz edildi. Diziler, SILVA veri tabanı kullanılarak en yakın sınıf / cins ile gruplandırıldı. Bu araştırma bağlamında toplam dokuz bilinen bakteri sınıfı bulunmuştur. En yaygın sınıf alfaproteobakteri olup, temel olarak dört grupta toplanacak şekilde toplam bakterilerin % 89,23'ünü oluşturur. Bunlardan en yoğun populasyonlar ise rhizobiales (% 88,85) ve sfingomonadales (% 0,21)'dir. Aktinobakteriler (% 3,94), basil (% 2,92), gammaproteobakteriler (% 1,69) ve betaproteobakteriler (% 0,74)'de bu grubu takip etmektedir. Ayrıca, bu çalışmada on sınıftan toplam on dört cins tespit edilmiştir. En baskın olanı metilbacterium'dur (% 88,83), rhizobiales sınıfından (% 88,85). Propionibakteri (% 3,58), dolosigranulum (% 1,69), streptokok (% 1,10) ve psödomonas (% 1,13) takip etmektedir. Bununla birlikte, PCR analizi sonuçlarında tespit edilmesine ragmen, NGS analizlerinde herhangi bir arkea grubu gözlemlenmemiştir. Bu durumun olası nedenlerine ise tartışma kısmında yer verilmiştir.