Evrimsel Mühendislik İle Elde Edilen Donmaya Dirençli Saccharomyces Cerevisiae’nin Karakterizasyonu

Abstract

Dondurarak saklama canlı hücrelerin uzun süreli muhafazası için endüstride kullanılan önemli bir araçtır. Dondurarak saklama uygulamaları esnasında maya hücreleri canlılıklarını etkileyebilecek olumsuz dış etkenlere maruz kalabilirler. Bu yüzden, mayanın donma direncinin arttırılması çok önemlidir. Bu amaç doğrultusunda, evrimsel mühendislik yaklaşımı gibi yöntemlerle özel olarak geliştirilmiş maya hücreleri ile çalışılarak, donma-erime stresine dirençte rol alan mekanizmaların anlaşılması büyük önem taşımaktadır. Evrimsel mühendislik, suş geliştirmede başarıyla kullanılan önemli bir stratejidir ve genetik çeşitliliği yüksek bir popülâsyon içinden istenilen özelliğe sahip bireylerin seçilmesi temeline dayanmaktadır. Bu çalışmanın amacı genetik, fenotipik ve fizyolojik bileşen ve belirteçlerin araştırılarak, donma erime stresine karşı geliştirilen direnç mekanizmalarının anlaşılmaya çalışılmasıdır. Önceki bir çalışmada, evrimsel mühendislik yöntemi uyarınca, -80°C ve sıvı azot (-196°C) stres şartlarında mutantlar elde edilip fenotipik karakterizasyonları ve çapraz direnç incelemeleri gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada, donma-erime ile ilgili 7 genin qPCR ile transkriptomik analizleri gerçekleştirilmiştir. Buna paralel olarak, hücre içi glikojen ve trehaloz seviyeleri belirlenmiştir. Ayrıca, hücre dışı glikoz, asetat, etanol ve gliserol üretim ve tüketim seviyeleri, HPLC ile yapılan analizlerden elde edilen verilerle hesaplanmıştır. Elde edilen sonuçların katı ve sıvı ortamda yapılan fenotipik karakterizasyon sonuçlarıyla örtüştüğü görülmüştür. AQY1, GSH1, CTT1 ve YAP1 genlerinin ekspresyon değerleri 905 suşuna normalize edildiğinde, bu genlerin ekpresyonunun mutant 5’te arttığı gözlenmiştir. Katı ortam ve HPLC sonuçlarına göre mutant 5’in, 905 ve mutant 23’ün aksine asetatı kullanamadığı görülmüştür. Sıvı ortam çalışmalarında, mutant 5, H2O2 tarafından indüklenen oksidatif strese karşı çok yüksek direnç göstermiştir. Yaban tipe kıyasla, mutantların hücre içi glikojen ve trehaloz değerlerinin kontrol koşullarında daha yüksek olduğu gözlenmiştir.

Cryopreservation is widely used in industry for storage of living cells. However, cryopreservation applications affect the viability of yeast cells. Thus, it is important to improve the freeze tolerance of baker’s yeast. To this end, understanding the freeze-thaw stress tolerance mechanisms in Saccharomyces cerevisiae is crucial. Evolutionary engineering is an important strategy for strain improvement, which is based on the selection of the mutants with a desirable phenotype among a genetically diverse population. The aim of this study was to gain more insight into the freeze-thaw stress tolerance mechanisms by investigating genetic, physiological and phenotypic components and indicators. In a previous study, -80ºC and liquid nitrogen (-196ºC) resistant mutants were obtained and selected using evolutionary engineering practices. In this study, these mutants were analyzed transcriptomically by examining the expression patterns of 7 known freeze-thaw related genes by using qPCR. In parallel with transcriptomic analysis, intracellular levels of glycogen and trehalose were determined. Besides, extracellular levels of glucose, acetate, ethanol, glycerol were obtained by HPLC analysis. These results were consistent with the phenotypic characterization results from solid and liquid media. Expression fold values normalized to 905 for AQY1, GSH1, CTT1 and YAP1 genes were found to be elevated in treated mutant 5. Solid media results showed that mutant 5 could not use acetate in contrast to other individuals. This finding was confirmed with the HPLC analyses. Individual 5 showed excessive tolerance to oxidative stress. Compared to wild type, intracellular glycogen and trehalose levels were higher in mutants under control conditions.