Escherichia Coli Hsp70 Moleküler Şaperon Homoloğu Dnak Proteininde Atpaz Aktivitesindeki Önemli Allosterik Bölgelerin Araştırılması

Abstract

70 kDa ısı şoku proteinleri (Hsp70) yeni sentezlenen proteinlere bağlanarak onları agregasyon ve denatürasyondan koruyan proteinlerdir. Ayrıca yanlış katlanmış proteinlerin yeniden katlanmasında ve protein translokasyonunda görev alırlar. Stres koşullarında, örneğin; artan sıcaklık, ağır metal ve oksitleyici içeren çevre koşullarında, anlatımları indüklenir. Echerichia coli Hsp70 homoloğu DnaK 44 kDa boyutunda ATPaz bölgesi ve 25 kDa boyutunda substrat-bağlanma bölgesi içerir. Bu iki parçanın birbirleri ile etkileşimi ATP hidrolizi kontrolünde gerçekleşir. ATP bağlanmasıyla substratın bağlanıp ayrılma hızında artış gözlenir ve substrata olan affinite azalır. ATP’nin ADP’ye hidroliziyle, substratın bağlanıp ayrılma hızı azalır ve substrat affinitesi artar. Bu döngünün kontrolünde hidrofobik, esnek ve evrimsel süreçte korunmuş bağlayıcı bölgenin rolü büyüktür. Daha önce yapılmış olan bilimsel çalışmalar kesilmiş, ATPaz bölgesi ve bağlayıcı bölgenin tamamını içeren DnaK(1-392)’nin tam dizim substrat-stimüle DnaK gibi davrandığını göstermiştir. Bu bilgiyi kullanarak, DnaK(1-392) proteininde bazı residüleri mutasyona uğratarak allosterik mekanizmayı anlamaya çalıştık. 226. pozisyondaki histidin mutasyonunda pH 5.5 ila 8.5 aralığında ATPaz hızının 3-kat arttığı gözlendi. 225. pozisyonundaki treonin mutasyonunda da benzer sonuçlar bulundu. Bu sonuçlar H226 ve T225 residülerinin ATPaz bölgesinin açılıp kapanmasında önemli olduğunu gösterdi. 85. pozisyondaki aspartik asit mutasyonunda pH’ya bağlı ATPaz aktivitesinde önemli bir düşüş gözlendi. Bağlayıcı tarafından stimüle edilmiş ATPaz aktivitesinin kaybolması, D85 residüsünün allosterik bir bölge olduğunu gösterdi. Sonuç olarak, bu çalışmada T225 ve H226’nın ATPaz mekanizması için önemli olduğu ve D85’in ATPaz aktivasyonu için kritik olduğu bulundu

Hsp70 chaperones play important roles in cells including protein folding, trafficking, degradation. DnaK is an Echerichia coli Hsp70 homolog comprising a 44 kDa ATPase domain and a 25 kDa substrate-binding domain. DnaK has two nucleotide substrate-affinity states: In the ATP-bound state, substrate binding and release occur rapidly with low substrate-affinity, whereas in the ADP-bound state, slower substrate binding and release kinetics are observed with high substrate-affinity. Communication between the two domains is essential for chaperone function and is mediated via a conserved, flexible, hydrophobic linker region. Previous studies showed that truncated DnaK(1-392), containing the ATPase domain and the entire linker region, mimics the substrate-stimulated form of full-length DnaK. Using this knowledge, we aimed to understand the allosteric mechanism underlying the substrate binding effects to the ATPase domain by pinpointing the putative residues that are present in this path using DnaK(1-392). We found that replacement mutations of histidine at position 226 caused 3-fold enhancement in the ATPase rates for pH values between 5.5 to 8.5. A similar result was obtained for threonine 225 replacement mutation. These results suggest that H226 and T225 sites are important for the opening and closing of the ATPase domain. Replacement of D85 caused a dramatic loss of pH-dependence of ATPase activity. This result suggests that linker stimulated ATPase activity was lost by this mutation, revealing D85 as an allosteric site. Overall, our study revealed T225 and H226 as important sites in the ATPase mechanism, and D85 as a critical point for ATPase activation at the linker stimulated form.