Kapiler Elektroforezine Dayalı Dna Dizileme Yönteminin Optimizasyonu Ve Mayada Karşılaştırmalı Genotip Analizi İçin Kullanılması

Abstract

DNA dizi analizi, Nobel ödüllü iki araştırmacı Frederick Sanger ve Walter Gilbert'in geliştirdikleri ilk dizileme yöntemlerinden beri moleküler biyoloji ve genetik alanındaki teknolojik gelişmelerin daima odağında olmuştur. Temelde her iki yöntemin de amacı DNA zinciri üzerindeki belirli bir noktanın nükleotit dizisini belirlemek olsa da, teknikler arasında önemli farklılıklar mevcuttur. Allan Maxam ve Walter Gilbert, DNA'nın modifikasyonuna ve belirli kimyasalların kullanılması ile belirli nükleotitlerde kesilmesi esasına dayanan bir DNA dizileme yöntemi geliştirirken, Sanger yönteminin ana prensibi zincir sonlandırıcı nükleotit olarak ddNTP'lerin kullanılmasıdır. Her iki yöntemin de kendine ait avantaj ve dezavantajları bulunmasına rağmen, zaman içerisinde Sanger DNA dizileme yönteminin otomasyona daha çok izin veren ve kullanıcı kolaylığı sunan bir teknik olduğu anlaşılmıştır. Halbuki başlarda Maxam-Gilbert yöntemi, saflaştırılmış DNA'nın doğrudan dizilenebilmesine imkan verdiği için çok daha popülerdi. Ancak, zincir sonladırma yönteminin zaman içinde iyileştirilmesi, otomatik sistemlere adapte edilmesi ve Maxam-Gilbert tarafından geliştirilen tekniğin çok karmaşık olması ve insan sağlığı açısından tehlikeli kimyasalların kullanımını içermesi gibi farklı etkenler nedeniyle Maxam-Gilbert DNA dizileme yöntemi eski önemini yitirmiştir. DNA dizi analizinin işlem hacmindeki asıl kayda değer gelişim, kapiler elektroforezine dayalı ayırım yönteminin jel tabanlı sistemlerin yerine kullanılmaya başlanması sonucunda yaşanmıştır. Kapiler elektroforezine dayalı DNA dizi analizi yöntemi, halen günümüzde hızla gelişmekte olan genomik ve proteomik alanlarına ışık tutmuştur. Daha teknolojik ve daha ileri dizileme sistemlerinin geliştirilmesine rağmen, DNA dizi analizinde halen 'altın standart' olarak adlandırılan bu yöntem, önemini hiçbir zaman kaybetmemekle birlikte, halen günümüzde en yaygın olarak kullanılan dizi analizi yöntemidir. Saccharomyces cerevisiae mayası, ökaryotik canlılarda gerçekleşen fizyolojik ve biyokimyasal olayları anlamak için dünyada en fazla ve en yaygın olarak kullanılan model organizmalardan biridir. Geliştirilen dizileme yöntemleri sayesinde, 6000 gen bölgesi içeren tüm genomunun dizi analizinin tamamlanmış olması ile ökaryotlar arasında öncü olmuştur. S. cerevisiae, sadece bilimsel çalışmalarda değil, ayrıca endüstriyel alanlarda da yüzyıllardır kullanılan tek hücreli bir ökaryottur. Doğal ortamlarında ve/veya endüstriyel uygulamalarda, mikroorganizmalar oksidatif, sıcaklık, dehidrasyon, besinsiz kalma ve metal iyonlarının varlığı gibi farklı stres koşullarına maruz kalmaktadırlar. Hem tek hücreli ökaryotik bir model organizma olması, hem de endüstriyel açıdan önemi sebebiyle S. cerevisiae mayası, hücresel stres direnci ve tepkisine yönelik araştırmalar için uygundur. Bu çalışmada S. cerevisiae mayasının referans suşu CEN.PK 113-7D ve bu suştan daha önce evrimsel mühendislik yaklaşımı ile elde edilmiş olan, çeşitli streslere dirençli suşlar kullanılmıştır. Oksidatif strese dirençli suş 'H7', kobalt-dirençli suş 'CI25E', nikel-dirençli suş 'M9' ve demir-dirençli suş '8C' olarak adlandırılmıştır. Karşılaştırmalı genotip analizinin deneysel çalışmalarından önce, kapiler elektroforezine dayalı DNA dizi analizi yöntemi en kapsamlı ve en kesin dizileme verilerinin alınabilmesi için bu çalışmaya yönelik özel olarak optimize edilmiştir. Çalışılan suşlardan DNA eldesi ve saflaştırılmasından sonuçların analizine kadarki tüm ara basamaklarda kullanılan kimyasalların ve tekniklerin optimizasyonu sayesinde deneysel çalışmalarda hedeflenen genotipleme analizi kalitesine ulaşılmıştır. Optimizasyonu her adımı için tamamlanan yöntem, çalışılan suşların belirlenen genleri için karşılaştırmalı dizi analizinde kullanılmıştır. Çalışılan referans ve mutant suşların DNA izolasyonu ticari bir kit kullanılarak üretici firmanın belirlediği çalışma protokolüne göre gerçekleştirilmiştir. PSE1, GRX4, MSN2, MSN4, MSN5, OCA1 ve CTT1 genlerinin Polimeraz Zincir Reaksiyon'ları (PZR) için özel olarak hazırlanmış reaktif karışımları ve çalışmaya özgü sıcaklık döngüleri her bir gen için ayrı ayrı optimize edildikten sonra kullanılmıştır. PZR ürünlerinin doğrulanması agaroz jel elektroforez sisteminde gerçekleştirilmiştir. Amplifikasyonu gerçekleştirilen gen bölgelerinin artık primer ve kullanılmayan nükleotitlerden arındırılması için enzimatik parçalama yöntemi kullanılmıştır. Saflaştırılan amplifikasyon ürünleri dizileme yöntemi için kalıp dizi olarak kullanılmıştır. Dizileme reaksiyonu sonrası artık olarak kalan işaretli-zincir sonlandırıcı nükleotitler kolon saflaştırma yöntemi sayesinde ortamdan uzaklaştırılmıştır. Dizileme yürütmeleri ABI 3130 Genetik Analizör cihazında gerçekleştirilmiştir. Dizi bilgilerinin analizi iki adımda gerçekleştirilmiştir. Dizi bilgisinin kalitesi ve dizileme yönteminin başarısının analizi için Sequencing Analysis v.6.0 programı kullanılmıştır. Çalışmanın güvenilirliği ve temizliği doğrulandıktan sonra, çalışılan her bir gen bölgesi için SeqScape v.3.0 programında bir proje açılmıştır. Her bir projeye, dizilemesi yapılan suşların ilgili gen bölgesi için dizi dosyaları, bilgi bankasından indirilmiş referans dizi ve analizler için özel olarak tanımlanmış analiz parametreleri yüklenmiştir. Açılan projelere yüklenen bilgiler kullanılarak, referans dizi dosyasının içeriği temel alınarak, referans suş CEN.PK 113-7D ve onun mutant suşları arasındaki nükleotit değişimleri analiz edilmiştir. Yapılan karşılaştırmalı genotip analizi sonucunda PSE1, GRX4 ve MSN5 genleri için CEN.PK 113-7D referans suş ile kobalt-dirençli suş CI25E ve demir-dirençli suş 8C arasında herhangi bir nükleotit farklılığı tespit edilmemiştir. CEN.PK 113-7D referans suş ile oksidatif strese dirençli suş H7 arasında yapılan ve MSN2, MSN4 ve OCA1 genlerini içeren karşılaştırmalı genotip analizi sonuçları ise her iki suş arasında nükleotit farklılığı bulunmamasına rağmen, analizler sırasında referans gen dizisi kullanılan diğer bir önemli referans suş olan S288C'nin çalışılan genler açısından CEN.PK 113-7D ve ondan elde edilmiş H7 mutant suşlarından farklılıklar gösterdiği tespit edilmiştir. Daha çok oksidatif stres ortamlarında etkinliği bilinen fakat farklı birçok stres koşullarının varlığında da stres etkenine karşı direnç geliştirilmesinde aktif rol oynadığı yapılan çalışmalarda gösterilmiş olan CTT1 geninin, CEN.PK 113-7D referans suş ile kobalt-dirençli suş CI25E, oksidatif strese dirençli suş H7 ve nikel-dirençli suş M9 arasında yapılan karşılaştırmalı genotip analizinde, H7 ve CI25E mutant suşların evrimsel mühendislik yöntemi ile elde edildikleri referans suş ile aynı genotipe sahip oldukları, nikel-dirençli suş M9'un ise DNA ekspresyonunun başlatıldığı bölge olarak bilenen düzenleyici dizi üzerinde referans suşundan bir nükleotitlik farklılık gösterdiği tespit edilmiştir.

DNA sequencing has been a main focus of technological development of molecular biology and genetic research since Nobel laureates Frederick Sanger and Walter Gilbert introduced sequencing by chain termination or chemical fragmentation techniques, coupled with gel electrophoresis-based separation. Remarkable improvements in data resolution were encountered when the separations of fragmented products were performed in capillaries versus slab gels. Since its invention, DNA sequencing by capillary electrophoresis technique has illuminated the future on genomics and proteomics studies. Although new sequencing strategies offering high-throughput data analysis have been developed, DNA sequencing by capillary electrophoresis technique still retains its global importance in genetic research. Saccharomyces cerevisiae is one of the most studied organisms and a common model organism in molecular cell biology to understand the eukaryotic cell. With the advent of DNA sequencing approaches, S. cerevisiae has been the first eukaryote the genome of which was completely sequenced. In addition to its use in scientific research, it has also been used for industrial applications such as brewing and baking for ages. In nature and/or industrial applications, microorganisms are exposed to a variety of stress conditions such as oxidative, temperature, dehydration, starvation, and metal ions stress. S. cerevisiae is suitable for stress-resistance studies, because of being a eukaryotic model organism and its industrial importance. In the present study, S. cerevisiae was used as a model organism. Oxidative stress-resistant strain 'H7', cobalt-resistant strain 'CI25E', nickel hyper-resistant strain 'M9' and iron-resistant strain '8C' had been obtained previously by evolutionary engineering approach, using the reference strain CEN.PK 113-7D. Before performing the experimental studies for comparative gene analysis between reference and mutant strains, all sections of the DNA sequencing by capillary electrophoresis method were optimized to obtain the most accurate sequencing data. Optimized protocols of the sequencing method were then applied to the experimental studies. DNA extraction from the reference and mutant strains was performed using a commercial extraction kit. Polymerase Chain Reaction (PCR) of PSE1, GRX4, MSN2, MSN4, MSN5, OCA1 and CTT1 genes was carried out in a thermal cycler using the specifically prepared PCR Master Mix for each region of interest and thermal conditions. Electrophoretic analysis of the PCR products was performed using an agarose gel. PCR products confirmed on agarose gels were then purified using the enzymatic purification method. Cycle sequencing reaction was performed using enzymatically purified amplicons in a thermal cycler. Sequencing reaction products were purified by spin-column purification method. DNA sequencing by capillary electrophoresis of the samples was performed on ABI 3130 Genetic Analyzer using the optimized sequence module. Data analysis of the samples was carried out in two steps. Sequencing Analysis v.6.0 software was used to investigate sequence quality and baseline clearness before comparative genotype analysis. For each gene studied, designated project including sequence data of the samples, reference sequence file of the S. cerevisiae and analysis parameters were created in SeqScape v.3.0 software. Comparative sequence analysis of each gene was performed between reference and mutant strains in detail.