The prevention of biofilm formation and prohibiting of the antibiotic resistance development

Abstract

Membrane bioreactors (MBRs) are powerful systems for wastewater treatment, especially for the removal of toxic compounds such as antibiotics. To address the inadequate removal of antibiotics and spread of resistance genes in wastewater treatment plants, this study investigated the impact of bioaugmentation with dried Eichhornia crassipes roots, Trichocladium canadense and Penicillium restrictum on MBR systems. Performance of the reactors in terms of pollutant removal, including antibiotics sulfamethoxazole (SMX), tetracycline (TET) and erythromycin (ERY) were investigated, while anaerobic reactors were optimized for potential for reclaiming value through biogas production. For deeper insight, the shift in microbial communities in sludge and biofilm were analyzed through Illumina sequencing. MBRs and AnMBRs were set up for the experiment, aerobic sets consisted of C1 (inoculum), C2 (inoculum + antibiotics), EC (inoculum + antibiotics + E. crassipes) and PR (inoculum + antibiotics + P. restrictum), and anaerobic sets consisted of A.C1 (inoculum), A.C2 (inoculum + antibiotics), A.EC (inoculum + antibiotics + E. crassipes), A.TC (inoculum + antibiotics + T. canadense). In the aerobic sets, the addition of E. crassipes into the MBR increased the COD (by 6%), antibiotics and transformation products removal efficiency. Removal efficiencies of 97%, 98% and 84% were obtained for removal of ERY, SMX and TET in E. crassipes added reactor, respectively. Furthermore, E. crassipes reconstructed indigenous and microbial communities. It modified the biodegradation network, increased the relative abundances of Chloroflexi, Proteobacteria and Nitrospirae and decreased Firmicutes, compared to control with antibiotics. The addition of E. crassipes also enriched Actinobacteria and Bacteroidetes while decreasing Chloroflexi and Saccharibacteria phyla in biofilm. Addition of P. restrictum alleviated membrane fouling, increased removal of the antibiotics while decreasing sorption onto solid phase. The results showed a shift in bacterial composition toward shaping an antibiotic resistant profile in bioreactor after bioaugmentation with P. restrictum, mostly because of phenotypic expression via quorum quenching activity of secreted metabolites from P. restrictum. In the anaerobic bioreactor, E. crassipes biomass mitigated some of the toxic effects of antibiotics on the microbial community and prevented negative impact on the archaeal community, and significantly increased average biogas production (by 37% compared to control without antibiotics and 42% compared to control with antibiotics) as well as antibiotics removal at anaerobic membrane bioreactor. Furthermore, bioaugmented reactors showed significant reduction of ERY (97%) and TET (83%) concentrations in effluent. Microbial community analysis revealed that the structure, which was shifted in the presence of antibiotics, was restored to a similar composition as control without antibiotics in the presence of dried E. crassipes roots. This was especially notable for the archaeal population, allowing a more balanced distribution of acetoclastic and hydrogenotrophic methanogens. Results for T. canadense anaerobic reactors indicated that with bioaugmentation with 20% T. canadense, membrane biofouling was slowed by 25%, chemical oxygen demand (COD) removal increased by 16% and higher efficiency removal of ERY and SMX was achieved. Furthermore, the bioaugmented T. canadense significantly increased the abundance and diversity of the archaeal community on the biofilm and bacterial phylum Firmicutes, a known bio-foulant, decreased by 14%, which indicated apparent impact on biofilm formation. Utilization of these biological agents in MBR systems offers simple yet powerful tools for preventing the emergence of antimicrobial resistance and dissemination of such pollutants into the environment while increasing performance of the reactors and producing biogas. Bioaugmentation of such agents can lead to efficient and self-sustaining wastewater treatment facilities in the future.

Membran biyoreaktörler (MBR) özellikle antibiyotikler gibi arıtılması zor ve zehirli (toksik) bileşiklerin uzaklaştırılmasında kullanılan önemli atık su arıtma sistemleridir. Membran biyoreaktörler (MBR'ler), aktif çamur prosesi ile membran modülünün birlikte kullanımından oluşur ve atık su arıtımı için gelişmiş bir teknoloji olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Membran biyoreaktörler, düşük çamur kaybı, kaliteli çıkış suyu, yüksek yükleme kapasitesi ve daha küçük karbon ayak izi gibi geleneksel atık su arıtma sistemlerine göre bazı işletme avantajlarına sahiptir. MBR'ler, yüksek mukavemetli, inatçı ve refrakter atık suların arıtımında yaygın olarak kullanılmaktadır. Antibiyotiklerin gideriminin konvansiyonel arıtma tesislerinde yeterli düzeyde yapılamaması, su arıtma tesislerinin çıkış suları ile antibiyotikler ve kalıntılarının doğal ortamlara dağıtılmasına neden olmaktadır. Bunun sonucunda subletal konsantrasyonlara maruz kalan doğal mikroorganizmalarda antibiyotik direnç genleri oluşmaktadır. Antibiyotik direnç genlerinin yayılımının engellenmesi için MBR sistemleri yüksek potansiyel göstermektedir. Ancak, MBR sistemde karşılaşılan önemli bir sorun olan, biyofilm oluşumuna bağlı membranın biyolojik kirlenmesidir. Biyolojik kirlenme, reaktörde doğal olarak bulunan mikroorganizmaların membranların batık yüzeyinde birikmesi ve ardından bir biyofilm tabakası halinde büyümeleri nedeniyle oluşur. Membran biyo-kirliliği, membran yüzeyinde biyofilm oluşması veya membranların tıkanması, MBR'lerde membran geçirgenliğini azaltan ana problem olmaya devam etmekte, membran performansını ve ömrünü önemli ölçüde azaltmakta ve MBR'lerin işletme maliyetlerini arttırmaktadır. Biyoaugmentasyon yöntemi, kültüre alınmış mikrobiyal suşların biyoreaktörlere eklenmesi olarak tanımlanır. Genelde bu yöntem MBR sisteminin çalışma verimliliğini arttırmak ve performansını değerlendirmek için kullanılmaktadır. Ayrıca yeni birçok çalışma, eklenen mikroorganizmaların antibiyotik gideriminde ve su arıtma üzerindeki olumlu etkilerini bildirmiştir. Birçok çalışma yapılmış olmasına rağmen, bu yöntemin geliştirilmesi ve etkilerinin araştırılmasında hala eksiklikler bulunmaktadır. Bu çalışmada bu eksiklere yönelik bir inceleme ve araştırma yapılmıştır. Tetrasiklin (TET), Sülfametoksazol (SMX) ve Eritromisin (ERY), yaygın olarak kullanılan ve dolayısıyla doğal ve atıksu ortamlarında önemli seviyelerde tespit edilen antibiyotiklerdir. ERY molekülleri aromatik yapıları nedeniyle bozulmaya dirençlidirler. Antibiyotiklerin toprağa, yüzey sularına sürekli deşarjı ve yeraltı sularına sızması ciddi çevre sorunlarına neden olmaktadır. Antibiyotiklerin yaygın kullanımı, modern tıbbın en ciddi sağlık sorunlarından birini temsil eden antibiyotiğe dirençli patojenlerin oluşumunu artırmaktadır. Doğal ortamlarda uzun süre antibiyotik bulunmasından kaynaklanan antibiyotiğe dirençli mikroorganizmaların yayılması, insan ve hayvanlarda görülen yaygın enfeksiyonların antibiyotiklere cevap verememesine neden olmaktadır. Yaygın enfeksiyonların antibiyotiklere direnç genlerinin çoğalması ve yaygınlaşması dolayısıyla tedavi edilememesi, antibiyotiklerin keşfi ve geliştirilmesi ile insanlığın önemli derecede artan hayat kalitesini ve uzamış ömür ortalamasını tehdit etmektedir. Bu çalışmada Eichhornia crassipes (Su Sümbülü) köklerinin tozu, Trichocladium canadense ve Penicillium restrictum fungus türleri anaerobik ve aerobik MBR setlerine eklenerek reaktörlerin arıtma, kirletici giderim verimlerine olan etkisi ve mikrobiyal komünite üzerinde neden oldukları değişimler araştırılmıştır. Aerobik ve anaerobik MBR'lerde reaktör performansı SMX, TET ve ERY antibiyotiklerinin giderimi ile birlikte kimyasal oksijen ihtiyacının (KOİ) giderim verimi üzerinden takip edilmiştir. Membran kirlenmesinin ilerleyişi transmembran basıncı (TMB) üzerinden membran modülü hatlarına monte edilen sensörlerle takip edilmiştir. Anaerobik reaktörlerde ek olarak biyogaz üretimine bakılmıştır. Daha derin bir kavrayış için, DNA izolasyonu Invitrogen PureLink Genomic DNA Mini Kit'i (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ile yapılmıştır. Çamurdaki ve biyofilmdeki mikrobiyal toplulukların değişiminin incelenmesi için reaktör çamurundan ve membran üzerinde biriken biyofilm katmanından üçer kez alınan örnekler Illumina dizilimi yoluyla analiz edilmiştir. Operasyonel Taksonomik Birimler (OTU'lar) kümelemesi, Uparse yazılımı (Uparse v7.0.1001) kullanılarak %97 kimlik kesintisi ile gerçekleştirilmiştir. E. crassipes ve T. canadense MBR setleri için optimal biyoaugmentör konsantrasyonların belirlenmesi için kesikli reaktör setleri kurulmuştur. E. crassipes optimal konsantrasyonu belirlenmesi için farklı konsantrasyonlarda 5 kesikli reaktör seti kurulmuştur. Toplam hacimleri 1'er litre, aktif hacimleri ise 0.5 litre olan kesikli reaktörlere 200, 400 ve 800 mg/l konsantrasyonunda kurutulmuş E. crassipes kökü tozu eklenmiştir. Optimal konsantrasyon KOİ giderim verimine göre belirlenmiştir. T. canadense konsantrasyon optimizasyonu için ise anaerobik koşullarda 100 mL (80 mL aktif hacim) serum şişelerinde %0 (kontrol), %5 (T1), %10 (T2), %15 (T3), ve %20 (T4) olacak şekilde çift setler halinde hazırlanmıştır ve optimal konsantrasyon en yüksek biyogaz üretimine göre değerlendirilmiştir. Deneysel çalışmaların yürütülmesi için aerobik ve anaerobik membran biyoreaktör setleri kurulmuştur. 5 litrelik cam biyoreaktörlere 0.125 m2 alana sahip membran modülleri eklenmiştir. Aerobik MBR setler: C1 (inokulum), C2 (inokulum + antibiyotikler), EC (inokulum + antibiyotikler + E. crassipes) ve PR (inokulum + antibiyotikler + P. restrictum) olarak ve anaerobik MBR setler: A.C1 (inokulum), A.C2 (inokulum + antibiyotikler), A.EC (inokulum + antibiyotikler + E. crassipes), A.TC (inokulum + antibiyotikler + T. canadense) olarak kurulmuştur. Aerobik setlerin besiyerinde glikoz, üre, (NH4) 2SO4, NaCl, KH2PO4, MgSO47H2O, CaCl22H2O ve NaCO3 kullanılmıştır. Giriş KOİ değeri 1200 mg/l olarak belirlenen sentetik substrat karışımı, reaktörlerin günlük sürekli beslenmesi için kullanılmıştır. Ayrıca, antibiyotik içeren reaktörlerin beslemesinde sırasıyla 100 mg l-1, 37.3 mg l-1 ve 100 mg l-1 konsantrasyonlarında ERY, TET ve SMX kullanılmıştır. Su sümbülü olarak da bilinen, bir su bitkisi olan E. crassipes, su ortamlarından kirleticileri absorbe ederek uzaklaştırma ve arıtma sağlama potansiyeline sahip olduğu birçok çalışmada gözlemlenmiştir. E. crassipes son yıllarda birçok araştırmaya konu olmuştur, ancak özellikle kurutulmuş toz formundaki organik ve inorganik bileşiklerin yanı sıra farmasötiklerin sucul ortamlardan uzaklaştırılmasındaki performansı kapsamlı bir şekilde çalışılmamıştır. Özellikle köklerinde yoğunlaşan sucul ortamlarda gerçekleşen kirletici adsorpsiyonu, büyük ölçüde iyon değişimine bağlıdır. E. crassipes'in ağır metal gidermedeki dikkate değer kabiliyetine ek olarak ortamın biyokimyasal oksijen ihtiyacı (BOİ), kimyasal oksijen ihtiyacı (KOİ), toplam çözünmüş katıları (TDS), toplam askıda katıları (TSS) ve toplam katıları (TS) üzerinde etkisi görülmüştür. Bu çalışmada E. crassipes'in membran kirlenmesi, kirletici giderim performansı ve antibiyotik giderimi üzerindeki etkisini araştırmak için kurutulmuş E. crassipes kökleri ile birleştirilmiş anaerobik MBR (AnMBR) sistemi, farmasötik atıksu arıtmasında kullanılmıştır. Anaerobik setlerde ayrıca biyogaz üretimi de değerlendirilmiştir. Ayrıca bu reaktör setlerindeki biyofilm ve çamur katmanlarındaki bakteriyel ve arkeal topluluk yapılarının değişimi incelenmiştir. Anaerobik setlerde E. crassipes'in absorpsiyon kabiliyeti, ERY SMX ve TET'in mikrobiyal topluluk yapısı üzerindeki olumsuz etkilerini azaltmış ve böylece biyogaz üretiminde A.C2'ye kıyasla %37 artış sağlamıştır. Mikrobiyal topluluk analizi sayesinde, antibiyotiklere maruz kalarak değişen mikrobiyal topluluk yapısının, kurutulmuş E. crassipes köklerinin varlığında antibiyotiksiz kontrol ile benzer yapıya geri döndüğünü görülmüştür. Arkelerde ise asetoklastik ve hidrojenotrofik metanojenlerin daha dengeli bir dağılımına izin vererek, biyogaz üretimine katkıda bulunmuştur. AnMBR'lerde E. crassipes biyogaz üretimini önemli derecede arttırmış olması, su arıtma tesislerinin kendi enerjilerini ve hatta daha fazlasını üreterek sürdürülebilir teknolojiler olmalarına katkıda bulunabileceğini göstermektedir. T. canadense (fungus, mantar), esas olarak büyümesi için gerekli olan lignoselülozik bileşikleri sahip olduğu etkili enzimleri kullanarak ve parçalayarak (enzimatik metabolik reaksiyonlar) elde etmektedir. Literatürde yapılan çalışmalar, lignini parçalayan fungusların ayrıca antibiyotikleri ve diğer farmasötikleri de parçaladığı bildirilmiştir. Bu nedenle T. canadense, antibiyotiklerin ve diğer farmasötiklerin bozundurulması için güçlü bir adaydır. T. canadense anaerobik membran reaktöründe kullanılacak optimal konsantrasyonun tespitinde, kesikli reaktörlerde yürütülen ön çalışma ile KOİ giderimi ve biyogaz üretimi bakımından diğerleriyle kıyaslandığında anlamlı bir artış göstermiş ve bu oran %20 olarak belirlenmiştir. T. canadense içeren MBR'de membran biyo-kirlenmesi hızının %25 oranında yavaşladığı, KOİ giderilmesinin %16 oranında artış gösterdiği ve ERY ve SMX'in daha yüksek verimlilikte giderilmesinin sağlandığı gözlenmiştir. Ayrıca, T. canadense biyoaugmentasyonu, biyofilm üzerindeki arke bakteriyel topluluğunun bolluğunu ve çeşitliliğini önemli ölçüde arttırmış ve bilinen bir biyo-kirletici olan Firmicutes bakteri filumunu, biyofilm oluşumunu kısıtlayarak membran üzerinde belirgin olumlu bir etkiyi göstermiş ve %14 oranında azaltmıştır. Aktif çamur işleminin verimine olumlu katkısı ve biyokirlenmeyi yavaşlatma kapasitesi ile daha ucuz ve kolay uygulama seçeneği olarak, T. canadense atıksu arıtma tesislerinde uygulanabilme potansiyelini göstermiştir. Aerobik setlerde E. crassipes'in MBR sistemine eklenmesi üzerine, KOİ gideriminin %6 arttığı ve yüksek antibiyotik ve transformasyon ürünlerinin giderimleri (%98) sağlandığı gözlenmiştir. E. crassipes içeren reaktörde ERY, SMX ve TET için sırasıyla %97, %98 ve %84'lük uzaklaştırma verimleri elde edilmiştir. Mikrobiyal komünite açısından bakıldığında, E. crassipes eklenmesiyle biyofilm mikrobiyal topluluklarının yeniden yapılandırıldığı gözlenmiştir. E. crassipes ilavesi (EC), biyofilmdeki Chloroflexi ve Saccharibacteria filumlarını azaltırken Actinobacteria ve Bacteroidetes'i de zenginleştirmiştir. Aerobik işlemlerde antibiyotik giderimi yüksek olduğundan dolayı özellikle toksik olabilecek transformasyon ürünlerini absorbe ederek uzaklaştırması, özellikle yüksek antibiyotik konsantrasyonları içeren atıksuların arıtımını yapan tesislerde kullanılması gelecek vaat etmektedir. Penicillium spp. düşük ortak substrat gereksinimleri ile çeşitli ksenobiyotik bileşikleri parçalama yetenekleri ile dikkat çekmektedir. Çok çeşitli çevre koşullarında yetişebilmeleri ve basit beslenme gereksinimleri nedeniyle Penicillium spp. bir çok ortamda bulunur. Çeşitli kirleticilerin, özellikle ağır metallerin ve ksenobiyotiklerin bulunduğu çeşitli ortamlarda koloniler oluşturabildikleri için bunların uzaklaştırılmasında önemli bir rol oynama potansiyeline sahip oldukları söylenebilir. Ortamdaki yerel bitkilerle simbiyotik ilişkiye girerek doğal bitkilerin büyümesine sağladığı diğer avantajların yanı sıra kirleticilerin toksik etkilerine karşı bitkilerin direncini arttırdığı bilinen endofitik Penicillium spp., biyolojik olarak arıtılmış kirli ortamlara uygulanabilir. Ayrıca, P. restrictum fungus türünün ürettiği quorum sensing kontrolündeki rolü bilinen polyhydroxyanthraquinones bileşiğinin, biyofilm oluşumunu azaltıp engellemesindeki potansiyeli taşıdığı gösterilmiştir. Bu çalışmada aerobik MBR'lere eklenen P. restrictum, reaktör içi işlemlerine olumlu etki sağlamıştır. PR reaktöründe membran tıkanması gecikmiş, katı faz üzerine antibiyotik sorpsiyonu azalmış ve antibiyotiklerin uzaklaştırılma yüzdesi artmıştır. Mikrobiyal kominitelere bakıldığında, P. restrictum eklenmesiyle aerobik mikrobiyal komünite profilinin dağılımını tekrar şekillendirdiği görülmektedir. Membran kirlenmesinin yavaşlaması ve mikrobiyal komünite dağılımlarına bakıldığında, P. restrictum 'dan salgılanan quorum quenching etkisi olan metabolitlerin etkisi olduğu söylenebilir. Membran tıkanmasına karşı bir biyoajan olarak ucuz ve kolay uygulanabilmesi gibi avantajları ile P. restrictum gerçek boyutlarda işleyen arıtma tesislerinde daha fazla araştırma yapılmasına ihtiyaç göstermektedir. Bu biyolojik ajanların MBR sistemlerinde kullanılması, reaktörlerin performansını arttırırken antimikrobiyal direncinin ortaya çıkmasını ve bu tür kirleticilerin çevreye yayılmasını önlemek için basit ama güçlü araçlar sunmaktadır. İleri arıtımda kullanılan membran biyoreaktörlerde oluşan biyotıkanmaların önüne geçilebilmek için tez kapsamında bakteriyel hücrelerin türler arasında birbiri ile iletişiminin engellenmesi (quorum quenching) ile birlikte membran tıkanıklığının ve antibiyotik direnç gelişiminin önlenmesi için uygulanabilir bir kontrol mekanizması geliştirilmesi hedeflenmiştir. Bu çalışmada biyolojik kirlenmenin geciktirilmesine ve MBR sisteminin maliyetini azaltmak ve oldukça zor ve zahmetli olan geri yıkama işlemini geciktirici, kolaylaştırıcı bir kaynak ve işlem sunması amaçlanmıştır. Bu tür biyolojik temizlik ajanlarının atıksu arıtımda kullanılmaları, atıksu kaynağı ve içeriğine bağlı olarak (yerel koşullara göre) optimize edilerek kullanılmaları, atık su arıtma tesislerin verimli ve sürdürülebilir işletilmesi ile daha ekonomik ve uygulanabilir arıtma proseslerinin geliştirilmesinde büyük önem taşıyacaktır.