Mikrotübül Kesilmesinin Regülasyonu

Abstract

Mikrotübüller, alfa ve beta tubulin heterodimerlerinden oluşan hücre iskeleti polimerleridirler. Hücre içi taşıma, hücre hareketi, hücre bölünmesi gibi olaylarda görevlidirler. Sinir hücrelerinde, MTler hücrenin büyümesine destek sağlamakla beraber hücresel yapının şekillenmesinde, akson ve dendritlerin oluşumunda da etkilidirler. Katanin ve spastin MT kesici enzimlerdir. Katanin iki alt üniteden oluşur, p60 ve p80. Spastin, p60–katanin alt ünitesi ile büyük benzerlik göstermektedir. Spastinin en fazla ilgi çeken proteinlerden biri haline gelmesinin nedeni de bu proteinin MT temel hücre biyolojisini nörolojik hastalıklarla birleştirmesidir. Spastinin mutasyonunda kalıtsal spastik parapleji rahatsızlığına neden olduğu bilinmektedir. Çalışmadaki hedefimiz spastinin karakterizasyonunda yeni adımlar atabilmek, MTlerin spastin, katanin tarafından kesilmesinin mikrotübül ilişkili proteinler tarafından düzenlenmesini aydınlatmaya çalışmaktır. Çalışmanın bu kısmında MTler üzerinde koruyucu görevleri olan mikrotübül–ilişkili proteinler, özellikle de MAP1b ve MAP2c üzerinde durulmuştur. Spastinin görevini aydınlatabilmek için hipokampüs hücrelerinde GFP, spastin, p60–katanin proteinlerinin ekspresyonu gerçekleştirildi. Hücreler transfeksiyonu takip eden 2. ve 4. günlerde sabitlendi. Birincil ve ikincil antikorlar ile boyandıktan sonra hücreler flüoresan mikroskobu ile incelendi. Kontrol hücreleri, katanin ve spastin proteinlerini aşırı eksprese eden hücreler aralarında karşılaştırıldı. Çalışmanın ikinci kısmında ise mikrotübül ilişkili proteinlerin, p60–katanin ve spastin eksprese eden hücreler üzerinde herhangi bir düzenleyici rolünün olup olmadığı aydınlatılmaya çalışıldı. P60–katanin ve spastin proteinleri mikrotübül ilişkili proteinlerin varlığında ya da bu proteinler olmadan fibroblast hücrelerinde eksprese edildiler. Transfeksiyonu takip eden günde hücreler sabitlendi. Birincil ve ikincil antikorlarla işaretlendikten sonra hücreler flüoresan mikroskobunda incelendiler.

Microtubules are cytoskeletal polymers made of alpha and beta tubulin heterodimers. They have role in cell transport, cell motility and cell division. In neurons, MTs provide support for the growth and maintenance of the axonal and dendritic processes. Katanin and spastin are MT severing enzymes. Katanin has two subunits, p60 and p80. P60 subunit has high homology with spastin. Spastin became popular because it has brought basic MT cell biology into the neurological disorders. It is known that spastin mutation leads to neurological disorder, hereditary spastic paraplegia. Our aim was to characterize spastin and also to identify the regulation mechanisms of MT severing by spastin and katanin. We concentrated on MAP1b and MAP2c proteins that have protective role over MTs. In the first part of the study, we have worked with hippocampus cells. We overexpressed GFP, p60 –katanin and spastin constructs in hippocampal cells. Cells were fixed at the particular time points following transfection. After fixation, immunostaining was done and then by using primary and secondary antibodies cells were analyzed with fluorescent microscopy. Control cells, p60 –katanin overexpressing and spastin overexpressing cells were compared with each others. In the second part of the work, MAP’s protective functions were analyzed in spastin and p60–katanin over expressing cells. P60 –katanin and spastin constructs were overexpressed with and without MAP1b and MAP2c in living fibroblast cells, RFL-6. Cells were fixed on the following day of transfection and stained with primary and secondary antibodies. After immunostaining, cells were analyzed with fluorescent microscopy.