Tersine Metabolik Mühendislik Yaklaşımıyla Propolise Dirençli Saccharomyces Cerevisiae eldesi

Abstract

Propolis, bal arılarının kovanlarını inşa etmek ve funguslar ile bakterilere karşı kovanlarını korumak için bitki ve ağaçlardan toplayarak oluşturdukları reçineli bir bileşiktir. Propolis eski zamanlardan beri yerel tıp alanında kullanılmaktadır. Saccharomyces cerevisiae ökaryotik bir maya hücresidir ve fungus alemine aittir. Hücre yapısı yuvarlak ve hücre büyüklüğü 10 µm ile 5µm arasında değişmektedir. S. cerevisiae oksijen varlığında glukozu karbondioksit ve suya kadar parçalarken, oksijen olmadığında glukozu etanole çevirerek oksijensiz solunum yapar. Maya hücreleri tomurcuklanma ile aseksüel üreme gerçekleştirirler. S. cerevisiae genom dizisi belirlenen ilk ökaryotik organizmadır ve diploid veya haploid formda bulunabilir. Bu tez çalışmasında tersine metabolik mühendislik yaklaşımıyla, propolise dirençli S. cerevisiae mayası elde edilerek fizyolojik açıdan incelenmiştir. Bu amaçla, öncelikle referans suş ve EMS ile rastgele kimyasal mutasyona uğratılmış S.cerevisiae suşu farklı konsantrasyonlarda propolis içeren ortamlarda büyümeye bırakılarak inhibe edici propolis konsantrasyonu ve seleksiyon deneylerinde kullanılacak propolis konsantrasyonu belirlenmiştir. Başlangıçta uygulanan propolis konsantrasyonu 150 µg/mL iken, propolis konsantrasyonu yavaş yavaş arttırılarak 57 mutant popülasyon elde edilmiştir ve 57. popülasyonda 710 µg/mL propolis stresi uygulanmıştır. Böylelikle propolise yüksek dirençli bir popülasyon elde edilmiştir. Son popülasyon seyreltilip katı YMM besiyerine ekilerek bu besiyerinden 12 farklı koloni rastgele seçilmiştir. Seçilen bu kolonilerin propolis direnci çeşitli fizyolojik analizlerle belirlenmiştir. Seçilen 12 mutant koloni, son popülasyon ve referans suşun propolis direncini belirlemek için öncelikle damlatma (spot) testleri gerçekleştirilmiştir. Hücreler farklı konsantrasyonlarda propolis içeren katı YMM ortamında üretilerek, üreme miktarları karşılaştırılmıştır. Damlatma test sonuçlarına göre, 12 mutant koloni arasından, en dirençli gözlenen 5 farklı koloni (FD7, FD8, FD10, FD11, FD12) seçilmiştir. Ayrıca 710 µg/mL propolis içeren katı besiyerinde mutant koloniler üreme güçlüğü çekmişlerdir. Bu durum, propolis stresinin katı ve sıvı ortamlardaki etkisinin farklı olabileceğini göstermektedir. Seçilen beş mutant bireyin propolis stresine olan direncini gözlemlemek amacıyla Most Probable Number (MPN) testi uygulanmıştır. Mutant koloniler 200 µg/mL, 500 µg/mL ve 710 µg/mL propolis stresi içeren MPN platelerine ekilerek, oluşan bulanıklık miktarlarından yola çıkılıp canlı hücre sayısı MPN tablosu yardımıyla hesaplanmıştır. MPN sonuçlarına göre ; mutant koloniler en iyi üremeyi 200 µg/mL propolis konsantrasyonunda göstermiş olup, en iyi üreyen mutant birey de FD11 mutant bireyidir. Çapraz direnç testinde ise propolise direnç geliştirmiş olan mutant bireylerin başka hangi stress türlerine de direnç kazandığı incelenerek karşılaştırma yapılmıştır. Bu amaç doğrultusunda 0.1-0.3-0.5-0.8 mM NiCl2 , 1-2-2.2 mM CoCl2, 0.1-0.3-0.4-0.5-0.8 mM CuSO4 , 0.5-1-1.5 mM H2O2 , 2-2.5-3 mM CrCl3, 10 mM ZnCl2, 0.5-1-1.5 M MgCl2, 15-25-30-35-40 mM NH4FeSO4, 15-20 mM MnCl2, 8-12 % (v/v) etanol , 12 mM AlCl3, 0.5-1 M NaCl, 150 µg/mL genetisin, 10 mM kafein içeren katı YMM besiyerinde damlatma testi uygulanmıştır. Test sonucuna göre mutant koloniler NiCl2, NH4FeSO4, genetisin ve kafein bileşiklerine dirençlilik fakat etanol ve H2O2 bileşiklerine karşı ise duyarlılık göstermiştir. Damlatma sonuçlarını desteklemek amacıyla mutant bireylerin direnç ve duyarlılık gösterdiği stress koşullarında MPN testi de uygulanmıştır. Genetik kararlılık testinde propolise karşı yüksek direnç gösteren FD10 ve FD11 mutant kolonilerinin propolise olan dirençlerinin kalıcı olup olmadığı araştırılmıştır. FD10 ve FD11 ardarda beş pasajlama boyunca propolis içermeyen taze besiyerinde üretilmiş ve bu suşlardan -80 oC stok kültürleri yapılmıştır. Daha sonra bu kültürler canlandırılarak YMM ve 250 µg/mL propolis içeren YMM ortamlarında MPN testi uygulanmıştır. MPN sonuçlarına göre FD10 ve FD11 kolonilerinin genetik olarak kararlı olduğu gözlenmiştir. FD11’in FD10’a göre daha yüksek bir üreme oranına sahip olduğu da görülmüştür. FD11 suşunun üreme eğrilerinin eldesi için öncelikle doz tarama deneyi uygulanmış ve deney sonuçlarına göre 200 µg/mL propolis konsantrasyonu referans suş ve FD11 mutantı için uygun propolis konsantrasyonu olarak belirlenmiştir. Üreme eğrisi deneyleri 200 µg/mL propolis içeren ve içermeyen (kontrol) besiyeri ortamlarında gerçekleştirilmiştir. Referans suş ve FD11’in 200 µg/mL propolis varlığında ve propolissiz ortamdaki optik yoğunluklarının 600 nanometre dalgaboyunda düzenli aralıklarla ölçümü ile üreme eğrileri elde edilip, birbiriyle kıyaslanmıştır. Üreme analizi sonunda, hücre kuru ağırlıkları da ölçülüp kıyaslanmıştır. Ayrıca; tüketilen glukoz, üretilen gliserol, asetat ve etanol gibi metabolitlerin miktarı yüksek basınçlı sıvı kromotografisi (HPLC) cihazı ile belirlenmiştir. Depo karbonhidratlarından trehaloz ve glikojen miktarları, enzimatik bir yöntem yardımıyla hesaplanmıştır. Son olarak, hücre içindeki oksidasyon düzeyleri reaktif oksijen deneyi ile saptanmıştır. Tüm bu çalışmalar referans suş ile propolise dirençli mutant suşun fizyolojik farklılıklarını belirlemek amacıyla yapılmıştır. Sonuç olarak, bu çalışmada propolise yüksek düzeyde direnç gösteren ve genetik açıdan kararlı bir S. cerevisiae mutant suşu elde edilmiştir. Yapılan fizyolojik analizler, mutant suşun kafein ve NiCl2 streslerine karşı çapraz direnç gösterdiğini ve hücre içi ROS düzeylerinin referans suşa kıyasla daha düşük olduğunu göstermiştir. Yapılacak genomik, transkriptomik ve proteomik analizler, S. cerevisiae’de propolis direnç ve tepkisinin moleküler altyapısının anlaşılmasına katkı sağlayabilecektir.

Propolis is a resinous, sticky and dark colored substance that bees produce by mixing their own waxes with resins obtained from plants. Propolis is a resiny compound that bees collect and use as a building material and to protect their hives against fungi and bacteria. Propolis has been used at least to 300 BC and its use continues today in natural medicine and personal products. Chemical content of propolis is quite complex due to more than 300 ingredients such as polyphenols, phenolic aldehydes, sesquiterpene quinines, coumarins, amino acids, steroids and inorganic compounds, which have been identified in propolis samples. S. cerevisiae is a eukaryotic organism, also named as baker’s yeast or budding yeast. S. cerevisiae cells are mainly oval-shaped but cell size varies between 10 µm long and 5 µm wide, according to environmental conditions. In the present study, propolis-resistant S.cerevisiae population was obtained under gradually increasing propolis stress levels, by using an inverse metabolic engineering strategy. Reference strain(905) and its mutagenised form (906) were screened under increasing propolis stress levels to determine the initial stress level for selection. 150 µg/ml propolis was chosen as the initial propolis level and it was increased by 10 µg/ml at each step during selection. Totally, 57 mutant populations were obtained and their survival rates decreased, when propolis levels were increased. EMS mutagenised population (906) gained resistance and showed growth even at 710 µg/ml propolis concentration. The final population was incubated on solid YMM plates and twelve individual mutant colonies were chosen randomly. These propolis-resistant colonies were tested for their propolis-resistance, using spot assay and MPN method. According to spot assay results, more resistant colonies were determined among twelve individual mutants. Colonies were named as FD7, FD8, FD10, FD11 and FD12. MPN method was used for quantification of propolis stress resistance of mutant colonies. MPN tests showed that FD10 and FD11 were the most resistant colonies to propolis. Cross-resistance tests were applied to propolis-resistant mutants to determine their potential resistance against other stress types. S.cerevisiae mutants were grown on solid YMM containing ; 0.1-0.3-0.5-0.8 mM NiCl2 , 1-2-2.2 mM CoCl2, 0.1-0.3-0.4-0.5-0.8 mM CuSO4 , 0.5-1-1.5 mM H2O2 , 2-2.5-3 mM CrCl3, 10 mM ZnCl2, 0.5-1-1.5 M MgCl2, 15-25-30-35-40 mM NH4FeSO4, 15-20 mM MnCl2, 8-12 % (v/v) ethanol , 12 mM AlCl3, 0.5-1 M NaCl, 150 µg/ml geneticin, 10 mM caffeine, to determine their potential cross-resistances. The genetic stability analyses were performed using FD10 and FD11 mutants, to test if their resistance is permanent or not. It was shown that the mutants tested were genetically stable. At last, growth curves and cell dry weight measurements of FD11 mutant and the reference strain were obtained and compared to each other. HPLC analysis was used to determine concentrations of important metabolites, such as residual glucose, glycerol, acetate and ethanol.Trehalose and glycogen levels were measured by an enzymatic assay. Finally, reactive oxygen species were detected by ROS assay for both reference strain and FD11, with and without propolis stress. To conclude, a highly propolis-resistant and genetically stable S. cerevisiae mutant was obtained in this study. Physiological analyses revealed that the mutant was cross-resistant against caffeine and NiCl2 stress and has lower levels of ROS generation. Future genomic, transcriptomic and proteomic analyses may help understand the molecular basis of propolis resistance and response in S. cerevisiae.