Protein Mühendisliği İle Candida Methylica Format Dehidrogenaz Enzimin Katlanma Mekanizmasının Aydınlatılması Ve Termostabilitesinin Arttırılması

Abstract

NAD+-bağımlı format dehidrogenaz (EC 1.2.1.2, FDH) metilotrofik mikroorganizmalarda metanol metabolizmasındaki son enzimdir ve formatın karbondioksite oksidasyonunu katalizlerken NAD+’yi NADH’e indirger. Endüstriyel açıdan en önemli rolü NAD+ ve format kullanarak NADH’i rejenere etmesidir. Birçok avantajına rağmen düşük termostabilitesi FDH enzimin en önemli dezavantajıdır. Bu tez çalışması başlıca üç kısma ayrılmaktadır. Öncelikle protein mühendisliği çalışmalarında oluşturulacak mutant enzimlerin kolay ve verimli saflaştırılabilmesi amacıyla Candida methylica mayasından klonlanmış olan NAD+-bağımlı format dehidrogenaz (cmFDH) enzimi için basit ve etkili bir protein saflaştırma metodu geliştirilmiştir. İkinci bölümde orjinal cmFDH enziminin katlanma mekanizması ve stabilitesi incelenmiştir. Protein dissosiayon sabitinin 10-13 M olarak hesaplandığı denge denaturasyon deneyleri cmFDH’in iki yapılı tek adım geçiş modeline göre katlanmamış hale geçtiğini göstermiştir. Kinetik deneyler sonucunda katlanma işleminin iki adımda gerçekleştiği gözlenmiştir. Fizyolojik koşullarda dimerik yapının dissosiasyon sabiti oldukça yavaştır (3x10-7 s-1). Son olarak, termostabiliteyi arttırmak amacıyla Pseudomonas sp. 101 ve Candida boidinii FDH’lerinin kristal yapıları temel alınarak hazırlanan cmFDH homolji modeli kullanılarak orjinal enzim üzerine protein mühendisliği stratejileri uygulanmıştır. Termodinamik ve kinetik sonuçlar dört mutasyonun, N187E, Q105R and N147R, M1C, orjinal cmFDH enziminin katlanma biçimini değiştirmeden stabiliteyi arttırdığını ortaya koymaktadır.

NAD+-dependent formate dehydrogenase (EC 1.2.1.2, FDH) is the last enzyme in the metabolism of methanol in methylotrophs and catalyzes the oxidation of formate anion into carbondioxide concomitant with the reduction of NAD+ to NADH. One crucial role of this enzyme in industrial redox chemistry is to regenerate NADH from NAD+ and formate. Although there are many advantages using FDH for this purpose, one problem is a lack of thermostability. The studies described in this thesis are divided into three parts. Initially, a simple and efficient molecular biological method was described to improve the purification of NAD+-dependent FDH from yeast Candida methylica (cmFDH). It allowed us to easily purify the constructed thermostabile mutants. The second section describes the folding mechanism and stability of dimeric native cmFDH. Equilibrium denaturation data yielded a dissociation constant of about 10-13 M. Findings showed that native cmFDH unfolds by two state single transition model in equilibrium. The kinetics of refolding and unfolding reactions revealed that the overall process comprises 2 steps. The rate of dissociation of the dimeric state in physiological conditions is extremely slow (k-2 ~ 3x10-7 s-1). Finally, protein engineering strategies were applied to increase the thermostability by using a homology model of cmFDH based on Pseudomonas sp. 101 and Candida boidinii. The thermodynamic and kinetic results suggested that four mutations, N187E, Q105R and N147R, M1C increased the stability while the folding and unfolding patterns of native cmFDH was not altered.