Bag-1’in Aşırı İfadesi Bad Serin 136 Fosforlanmasını Sağlayarak Mcf-7 Meme Kanseri Hücre Hattında Sağkalımı İşaret Eder

Abstract

Bcl-2 asosiye athano gen (Bag) ailesi (Yunanca ölüm karşıtı athanostan) proteinleri anti-apoptotik Bcl-2 proteini ile ko-immunopresipitasyon sonucu bulunmuşlardır. Bag genleri evrimsel olarak korunmuştur ve mayalarda, bitkilerde ve hayvanlarda homologları mevcuttur. Bag ailesi üyeleri iki farklı yolla hücre homeostazını kontrol eder: (1) Hem pozitif hem negatif şekilde Hsp70/Hsc70 moleküler şaperon sisteminin çalışma döngüsünü regüle ederek hücrenin yaşamsal faaliyetlerini normal ve stres koşullarında sürdürmesine katkıda bulunur. Buna spesifik bir örnek, hücrenin normal ve stres halleri arasındaki dengesinin yönünün Bag-1’e Hsp70 ya da Raf-1’in yarışmalı bağlanması sonucu sağlanması ile verilebilir. (2) Apoptoz, tümör oluşumu, nöronal farklılaşma ve hücre döngüsü gibi birçok fizyolojik süreci kontrol eden transkripsiyon faktörleri ve reseptörler ile Hsp70/Hsc70 sisteminden bağımsız olarak kompleksler oluşturur. Bag ailesi üyelerinin, insanlarda, kanser, AIDS ve Parkinson gibi kompleks hastalıklarda normal hücrelere kıyasla ekspresyon düzeylerinde ve hücre içi lokalizasyonlarında değişiklikler gözlenmektedir. Dolayısıyla, bu tip hastalıkları tahlil etmede Bag proteinlerinin hücre içi ekspresyonlarını ve lokalizasyonlarını incelemeye yönelik çalışmalardan yararlanılabilir. Örneğin, kanserli meme hücrelerinde yapılan çalışmalarla Bag-1 ekspresyonunun, hastalığın seyrinin izlenmesinde prognostik bir markör olarak kullanılabileceği gösterilmiştir. Belirlenmiş Bag proteinleri Bag-1 (RAP46/HAP46), Bag-2, Bag-3 (CAIR-1/Bis), Bag-4 (SODD), Bag-5 ve Bag-6 (BAT3/Scythe) olup hepsi C-terminus yakınında BAG domen (BD) ifadesine sahiptir. Bag proteinlerinin genellikle N terminuslarında farklılık göstermesi her bir Bag ailesi üyesinin çeşitli proteinler, yolaklar ve/veya lokalizasyonlara göre spesifite göstermesini sağlar. Hücrelerde Bag-1 izoformlarinin ekspresyon düzeyleri farklılık göstermektedir. Bu izoformlar hücrelerde bulunma sıklıklarına göre Bag-1S, Bag-1L ve Bag-1M olarak sıralanabilir. Buna rağmen tümörlü hücrelerde ekspresyon düzeyi en yüksek olan Bag-1L izoformudur. Bunun nedeni ise Bag-1L’nin nüklear lokalizasyonuna bağlı olarak transkripsiyon faktörlerinin aktivitesini yönlendirmesi ve böylece hücre proliferasyonunu dolaylı yoldan tetiklemesi olabilir. Bag-1 izoformlarının hücrelerde daha önce yapılmış çalışmalar sonucu belirlenmiş etkileşim partnerleri; Bcl-2, Raf-1, Hsc70/Hsp70 sistemi, nükleer hormon reseptörleri (NHR), ubikuitin/proteozom mekanizması ve DNA dır. Bu etkileşimlerle Bag-1 izoformları, hücre büyümesi için kritik sinyal iletimi, proliferasyon, transkripsiyon gibi hücresel mekanizmalardan, hücre hareketi ve apoptoza varana kadar normal, malignan ve stres altında bulunan hücreler için önemli kontrol yolaklarında görev almaktadır. Bag-1 izoformlarinin belirtilmiş olan geniş perspektifli bu hücresel aktiviteleri genel olarak Bag ailesi üyeleri için tanımlandığı gibi iki farklı şekilde kontrol ettiği literatürde yer almaktadır: (1) Hsp70/Hsc70 sistemi ile etkileşim yoluyla, (2) nüklear hormon reseptörlerine (NHR) bağlanmasıyla. Bag-1 izoformlarinin Hsp70/Hsc70 moleküler şaperon sistemi ile etkileşiminde BAG domenleri Hsc70’in ATPaz domeninine bağlanır, konformasyonel değişiklikler yaratarak ADP’nin ATP ile değişimine etkide bulunur ve sonuçta bu şaperonların peptit bağlayan domenlerinin substrat proteinleri ile olan bağlanma/ayrılma kinetiklerini regüle eder. Bu şekilde bozunmuş hedef proteinin yeniden katlanıp katlanmayacağı kontrol edilmiş olur. Bag-1 izoformları, Hsp70/Hsc70 sistemini hem pozitif hem de negatif yönde kontrol ederek sırasıyla hücrelerin efektif bir şekilde protein üretebilmesi sonucu hücre büyümesine ya da hücrelerin protein üretiminin yavaşlaması sonucu hücre ölümüne yol açabilir. Fakat bu kritik ayarlamada, henüz Bag-1’lerin Hsp70/Hsc70 sistemine tam olarak moleküler düzeyde nasıl bir kontrol mekanizması ile etkide bulunduğu net olarak bilinmemektedir. Şu ana kadar yapılmış bu konudaki çalışmalar tutarsız sonuçlar ortaya koymaktadır. Bazı çalışmalar Bag-1M’nin Hsp70/Hsc70 sistemine bağlanması sonucu oluşan konformasyonel değişikliğin ADP’nin ATP ile değişimine imkan vermeyerek protein katlanmasını engelleyici özellik gösterdiği yönündedir. Bunun yanı sıra, bir çalışmada Bag-1S’nin protein katlanmasına pozitif yönde bir etki göstermesine karşın daha sonra yapılan bir çalışmayla negatif yönde bir etkide bulunduğu ortaya çıkartılmıştır. Bu konudaki belirsizlikler, Bag-1 izoformlarının Hsp70/Hsc70 sistemi üzerinden hücre yaşamındaki etkilerinin anlaşılmasını güçleştirmektedir. Bu durumla ilgili çeşitli hipotezler ortaya atılmış ve bunları destekleyici bazı sonuçlara ulaşılmıştır. Kritik yolakların aydınlatılması yolunda literatürde yer alan örnekler aşağıda özetlenmektedir. Bag-1’in Hsc70 ile etkileşimi sonucu Bcl-2 ile bir kompleks oluşturduğu gözlemlenmiştir. Anti-apoptotik Bcl-2 ile Bag-1’in etkileşimi, öncelikle Bag-1’in C-Raf (Raf-1) serin/treonin kinazı ile kompleks oluşturması sonucu gerçekleşir. Bunun sonucunda hücrenin yaşam ya da ölüm kaderini belirleyecek etkileşimlerin tetiklendiği ortaya çıkartılmıştır. Bag-1/C-Raf kompleksinin apoptoz öncüsü Bad (pro-apoptotik) proteinini fosforilasyonu sonucu, halihazırda hücrede bulunan Bcl-2’nin anti-apoptotik etkisini baskılayan Bcl-2/Bad etkileşimlerinin bozulabileceği ve böylelikle Bcl-2’lerin serbest kalarak apoptoz öncüsü Bax’in dimer oluşturmasını engellemesiyle hücrenin yaşamasının sağlandığı düşünülmektedir. Bu çalışmayla amaçlanan, MCF-7 meme kanseri hücre hattında Bag-1-ilişkili sağkalım mekanizmasının moleküler detaylarının aydınlatılmasıdır. Bu amaç doğrultusunda Bag-1’in ekspresyon seviyeleri değiştirilmiş ve hücreye etkisi incelenmiştir. Bag-1’in aşırı ekspesyonunu sağlama amacı ile TAP-tag içeren Bag-1’in ekspresyonunu arttıran plazmit; Bag-1’i susturmak için ise Bag-1’e özgü siRNA kullanılmıştır. Bag-1’in ekspesyonundaki değişikler western blotlama ile doğrulanmıştır. Bag-1’in aşırı ifadesinin hücre canlılığına yaptığı pozitif etkiler XTT hücre canlılığı ve tripan mavisi sağkalım deneyleri ile gösterilmiştir. Bag-1’in aşırı ifadesinin MCF-7 meme kanseri hücrelerinde sağkalımı arttırdığı gösterildikten sonra sağkalım yolağında görev yapan proteinlerin ekspresyonunun Bag-1 ekspresynundaki değişimlerle birlikte nasıl etkilendiği western blotlama ile araştırılmıştır. Western blot analizi sonuçları önemli MAP (mitogen-activated protein) kinazlar olan B-Raf ve C-Raf ekpresyonlarının Bag-1 aşırı ifadesi ile arrtığını göstermiştir. Ayrıca B-Raf’ın Serin 445, C-Raf’ın Serin 338 ve 289/296/301, Akt’nin Serin 473 bakiyelerinden fosfoslanma seviyelerinin ve Hsp70 expresyonunun da Bag-1 aşırı ekspesyonu ile arttığı, Bag-1’in susturulması ile azaldığı da western blotlama ile gözlemlenmiştir. Bag-1’ın hücre sağkalımını tetiklediği gösterildikten sonra Raf-Erk-MEK sinyal yolağının alt akışında bulunan proteinlerin de (Erk ve MEK) ekspresyonunu arttırdığı gösterilmiştir. Östrojen bağımlı meme kanseri hücrelerinde Bag-1’in bu sağkalım kompleksindeki etkileşim partnerlerini incelemek için ko-immünopresipitasyon yapılmıştır. Bag-1, fosforlanmış Akt, B-Raf, C-Raf, Bcl-2 ve Hsp70’in oluşturduğu bir kompleksin hücrede sağkalım mekanizmasını tetiklediği gösterilmiştir. Bag-1’in hücre içinde forforlanmış Akt, B-Raf, Bcl-2, Hsp70 ve C-Raf ile birlikte lokalize olduğu immüno hücre boyaması ile ispatlanmıştır. Daha önce sinir hücreleri (birincil hücre hattı) ile yapılan bir çalışmada Bag-1-ilişkili sağkalım kompleksine C-Raf’ın dahil olmadığı bulunmuştur.

Bcl-2 associated athanogene family (athano = against death in Greek) proteins are discovered by co-immunoprecipitation with Bcl-2 anti-apoptotic protein. Bag genes are evolutionally conserved and their homologes exist in yeasts, plants and animals. Bag family members control the cell homeostais in two different ways: (1) They contribute to maintain cell’s vital activity under normal and stress conditions via regulating both positively and negatively the cycle of Hsp70/Hsc70 molecular chaperone system. For instance, the direction of the cell balance under normal and stress conditions are maintained by competitive binding of Hsp70 or Raf-1 to Bag-1. (2) They form complexes with transcription factors and nuclear hormone receptors, which are controlling various physiological processes such as apoptosis, tumorigenesis, neural differentiation and cell cycle independent from Hsp70/Hsc70 system. Bag-1 isoforms are produced by the alternative translation initiation of single mRNA transcript; thereby they differ in their N-terminus related to translation initiation. Bag-1 isoforms appear to be differently localized in the cells. Main Bag-1 isoforms which are observed in humans are Bag-1S (36 kDa), Bag-1M (46 kDa) and Bag-1L (50 kDa). There is also another isoform of Bag-1, 29 kDa, however, it is very scarce in the cell, and thus is not consistently detected. All of Bag-1 isoforms commonly contain both the ubiquitin-like domain (ULD) and Bag domain (BD) in their C-terminus. Even though ULD domain function is not clearly known, its evolutionary conservation and its relations with proteosome machinery indicate that ULD is necessary for stress tolerance. Bag-1L is localized in nucleus by means of its nuclear localization signal (NLS). NLS does not exist in Bag-1M, which is known to be cytosolic but some studies revealed Bag-1M translocation to nucleus via companion proteins, Bag-1S, on the other hand, always presents in cytosol. N-terminus of Bag-1L and Bag-1M consist of eight TXSEEX repeats. It is shown that these repeats have a role in DNA binding and transcription activation depending on their nuclear localizations. Having less repeat sequences, Bag-1S is the shortest isoform in the cells. Bag-1 has many critical roles in the cell through its interactions with certain target molecules to regulate carcinogenesis, differentiation, motility, proliferation, cell survival, apoptosis and transcription. Nuclear hormone receptors, Siah, CHIP, HGF receptor, Hsp70/Hsc70 complex, Bcl-2, and C-Raf (Raf-1) are known interacting partners of Bag-1. Cell survival and apoptosis are the two major pathways that Bag-1 is involved in. Bag-1 interactions with C-Raf or Bcl-2 are main mechanism that determine cell fate. Through these interactions Bag-1 gets invoved in the regulation the balance between cell death and cell survival. Although Bag-1 involvement in different mechanisms is known, the molecular details of these mechanisms and crosstalk between the pathways are not clear yet. In this study, we aimed to elucidate the molecular mechanism of Bag-1-associated cell survival in MCF-7 breast cancer cell line. To understand Bag-1’s influence on cell survival, we altered expression levels of Bag-1 in MCF-7 cells. TAP tagged-Bag-1 overexpressing plasmid was used for enhencement of Bag-1 level, and Bag-1 specific siRNA transfection was applied for down regulation of Bag-1. XTT cell proliferation assay and tryphan blue dye exclusion assay were performed to explain Bag-1’s effect on cellular level. Western blot analysis was used for checking expression levels of proteins that take part in cell survival and signaling pathways to investigate changes in the expression after Bag-1 overexpression or silencing. To deduce molecular details of Bag-1-related cell survival we checked interaction partners of Bag-1 during cell survival using co-immunoprecipitation. We also did immunocytochemistry to demonstrate subcellular co-localization of Bag-1 with its interaction partners from the cell survival complex. Our results showed that C-Raf is involved in the complex that is formed by B-Raf, Hsp70, phospho-Akt and Bcl-2 in order to phosphorylate Bad at serine 136 residue for the prevention of apoptosis.