Nano-Biotechbological application of inorganic binding proteins

Abstract

Bir çok organizma protein anorganik etkileşimlerinden meydana gelen organik-anorganik hibrid sistemler içerir. Bu hibrid sistemlerin koruyucu tabakalar vedestekleyici dokular oluşturmak, yük ve iyon transferi yapmak, bazı optik vemekanik özellikler geliştirmek gibi mükemmel fonksiyonları mevcuttur.Çeşitlendirilmiş fonksiyonlara sahip bu sistemler, biyoteknoloji ve nano-biyoteknoloji alanında kullanılabilecek yeni sistemlerin tasarımında örnek teşkil eder(biyobenzetim). Anorganik yüzeyleri tanıma ve kuvvvetli bir şekilde tutunmaözelliğine sahip olan peptitlerin (GEPI) kullanılmasını esas alan bir yaklaşım ilenanoparçacık ve biyomoleküllerin istenen anorganik yüzeye immobilize edilmesi yada yeni özellikte nanoyapıların sentezlenmesi mümkündür.Biyomoleküllerin anorganik yüzeylere immobilizasyonları aktivite ve stabilite artışısağlaması amacıyla önemlidir. Kimyasal immobilizasyon yöntemleri ile elde edilensistemler biyomolekülün aktivitesinde azalmaya ya da kayba neden olabilmektedir.Bu nedenle GEPI'ler aracılığı ile immobilizasyon denenmiş ve başarılı örnekler eldeedilmiştir. GEPI aracalıklı immobilzasyonda peptidler, biyolojik molekülle birlikteüretilerek çift foksiyonlu bir molekül elde edilir. Molekül peptidden gelen yüzeytanıma özelliği ile matrikse tutunurken, biyomolekülü oluşturan bölge istenenbiyolojik fonksiyonu göstermeye devam eder. Bu tür bir tutuklanma sistemindeprotein yapısının kimyasal reaksiyonlarla bozunması ya da yüzeye kontrolsüz olarakbağlanması engellenmiş olur. Bu çalışmada altın yüzeye özgün bağlanan iki farklıpeptid sırasıyla Huntingtin proteinini ve Lactate dehidrogenaz enziminin altınyüzeylere tutuklamak amacıyla kullanılmıştır.Çalışmanın ilk kısmında altın yüzeye özgün bağlanan GBP1 peptidi, Huntingtinproteininin N-terminal ucuna eklenerek proteinin altın sensör yüzeyine bağlanmasınaaracılık etmek amacıyla kullanılmıştır. Huntingtin proteini mutant formundaHuntington hastalığına neden olan ökaryotik bir proteindir. Proteinin mutant formuN-terminal bölgesindeki glutamin tekrarlarının sayısında artış meydana gelmişhalidir. Normal protein 35 ve daha az glutamin tekrarı içerirken, mutant proteinde busayı 110 a kadar ulaşabilmektedir. Glutamin tekrarlarındaki artış miktarı hastalığınseyri ile doğru orantılı bulunmuştur. Hastalığın en belirgin hücre patalojisisitoplazma ve nukleusda inklüzyon cisimciklerinin gözlenmesidir. ?nklüzyoncisimcikleri mutant proteinin agregatlar oluşturması sonucu meydana gelir. Bir gruparaştırmacı hastalık patalojisinde etkin mekanizmanın protein agregasyonu sonucuolaşan fibril yapıların varlığı olduğunu düşünmektedir. Ancak fibril yapılarınsayısında azalma olmaksızın hastalık patalojisinin engellenebildiği durumlarınvarlığı, bazı araştırmacıların fibrilasyonun aslında hücrenin korunma mekanizmasıolduğunu düşünmelerine yol açmıştır. Hastalık oluşumunun daha iyi anlaşılabilmesive etkin tedavi yöntemlerinin geliştirilmesi için Huntingtin fibrillasyon mekanizması çalışılmaktadır. Ancak şu ana kadar farklı fibrillasyon basamaklarında meydanagelen agregasyon kinetiği nicel olarak araştırılmamıştır. Biz yüzey plazmon resonanspektroskopisini kullanarak (SPR) Htt fibrilasyon kinetiğini incelemeyi hedefledik.Yüzey plasmon rezonans spektroskopisi çalışmalarında proteinlerin altın sensoryüzeyine immobıilize edilmeleri gerekmektedir. Altın yüzeyine proteinimmobilizasyonunu gerçekleştirmek için GBP1 kullanılmıştır. GBP1-Htt füzyonproteinleri hem fibril hem de proto-fibril formlarda SPR yüzeyine tutuklanmışlardır.Ardından monomer haldeki Htt proteinleri yüzeye tutuklanmış fibril yapılarınüzerine gönderilerek bağlanma kinetikleri incelenmiştir. Kontrol olarak Htt fibril veproto-fibril yapıları altın yüzeyine kovalent immobilizasyonla tutuklanarak dadeneyler tekrar edilmiştir. Kontrol çalışmaları GBP1 aracılıklı immobilziasyon ile enaz kovalent tutuklanma kadar etkin bir immobilizasyon gerçekleştirildiğinigöstermiştir. Ayrıca fibril ve proto-fibril uzamasının kinetiğinin incelenmesineolanak sağlamıştır.Elde edilen veriler, fibril uzaması için iki basamaklı bir fibrillasyon modeliönerilmesine sebep olmuştur. Model, ilk basamakta monomerin fibril ucunaeklenmesini, ikinci basamakta ise konformasyonel değişimini içermektedir. Bukonformasyonel değişim sonucu monomer artık fibrilin bir parçası haline gelmiş veyeni eklenecek olan monomer proteinlerle etkileşmeye hazır hale gelmiştir. Proto-fibril uzamasında ise tek basamaklı bir fibrilasyon kinetiği modeliönerilebilmektedir. Bu modele göre monomer proto-fibril ucuna eklenmiş veuzamaya neden olmuştur. Fibril ve proto-fibril uzamaları için elde edilen dengesabitleri, fibrilasyonun başlangıç aşamalarında daha yavaş olduğunu göstermiştir. Buveri nükleasyona dayalı polimerizasyon olarak değerlendirilen Huntingtin fibriluzamasını destekler niteliktedir. Bu modelde fibrilasyonun başlaması için önceliklebir nukleus oluşumu gerekliliği ve bu basamağın da hız kısıtlayıcı basamak olduğudüşünülmektedir. Proto-firbil uzamasının da bu nedenle fibril uzamasından dahayavaş olması anlamlı bulunmuştur. Çünkü proto-fibriller aslında nukleus dan dahabüyük ancak henüz fibril büyüklüğüne ulaşmamış ara yapılardır. Elde edilenfibrilasyon kinetiği verileri ile hastalık tedavisi için geliştirlen olası ilaçprokürsörlerinin agregasyona etkileri araştırılabilir. Ayrıca GBP1 aracıklıimmobilizasyon diğer agregasyon profili gösteren proteinlerin kinetiklerininincelenmesinde de kullanılabilir bir yöntem olarak sunulabilir. Bu sayede Huntingtonbenzeri nörodejeneratif hastalıkların da araştırılması mümkün görülmektedir.Çalışmanın ikinci kısmında diğer bir altına özgün bağlanan peptid olan AuBP2(WALRRSIRRQSY), LDH enziminin N-terminaline eklenmiş ve enzimin altınyüzeyine immobilizasyonunda kullanılmıştır. Laktat dehidrogenaz enzimi birçokorganizma tarafından üretilmektedir. Ancak bu çalışmada aktitesi ve üç boyutluyapısı aydınlatılmış olanı termostabil organizmalardan Bacillus stearothermophilustarafından üretilen enzim (bsLDH) kullanılmıştır. bsLDH NADH/NAD+ kofaktörçiftini kullanarak pürivat (oxo asid) ve laktat (hydroksi asid)'ın dönüşümünükatalizlemektedirler. Reaksiyon ürünleri yarı-sentetik penisilin ve antihipertensiflergibi farmasötiklerin yapımı ve fenilketonürinin tıbbi tanısında kullanılmaktadırlar.Ayrıca diyagnostik alanında lactat miktarının tayininde yararlanılan bir enzimdir.Son zamanlarda ise nano boyutlu bio-enerji sistemlerinin geliştirilmesinde bir redoksenzimi olan LDH'in direk elektron transferini sağlama özelliğinden yararlanılmasıüzerine çalışılmaktadır. Hem biyosensör hem de biyo-enerji sistemlerinde LDH'denyararlanabilmek için uygun bir matrikse immobilize edilmesine ihtiyaç vardır. Bu çalışmada, kimyasal tutuklama yöntemlerine alternatif olarak LDHimmobilizasyonunu AuBP2 peptidi aracılığı ile gerçekleştirilmiştir. AuBP2 peptiddizisi, rekombinant DNA teknoloji kullanılarak LDH proteinin N-terminal ucunaeklenmiştir. Oluşturulan füzyon proteinin LDH aktivesi göstermeye devam edipetmediği enzim aktivite tahlilleri ile test edilmiştir. Sonuçlar AuBP2 eklenmesininLDH aktivitesinde ciddi bir azalmaya sebep olmadığını göstermiştir. Ardından yüzeyplazmon resonans spektorskopisi kullanılarak füzyon proteinin altın yüzeyebağlanma ilgisi araştırılmıştır. SPR sonuçları AuBP2 varlığında enzimin altın yüzeyeilgisinin on kat kadar arttırıldığını ve yüzeye tutuklandıktan sonrauzaklaştırılmadığını göstermiştir. Bu çalışmalar ile AuBP2-LDH füzyon proteininhem altın yüzeye bağlanabildiği hem de LDH aktivitesi göstermeye devam ettiğibulunmuştur.Füzyon proteinin immobilize halde iken ne kadar aktif olduğu da enzimler altın nanoparçacıklara tutuklanarak incelenmiştir. Enzimlerin immobilizasyon sonrası serbestenzime kıyasla %80 civarında aktivite gösterdikleri bulunmuştur. Enzimimmobilizasyonlarında %50 üzerinde immobilize aktivite elde etmenin iyi bir veriolduğu düşünüldüğünde AuBP2 ile immobilizasyonun etkinliği görülmektedir.Ayrıca immobilize enzimlerin 30 güne kadar aktivitelerini korudukları da izlenmiştir.Serbest enzimler ise 30 gün sonunda immobilize enzime kıyasla daha fazla aktivitekaybına uğradıkları gözlenmiştir.Son olarak, LDH enziminin redoks raksiyonunu incelemek amacıyla siklikvoltametri çalışması yapılmıştır. Bu çalışmada AuBP2-LDH altın elektrod yüzeyineimmobilize edilmiştir. Sisteme substrate olarak laktat ve kofaktor olarak NADbeslenmiştir. Elektrod yüzeyine potansiyel farkı uygularak, redüklenme veoksitlenme reaksiyonları izlenmiştir. Siklik voltametre analizlerinde enzimin NADredüksiyonu gözlenmiştir. Bu gözlem, hem biyosensör hem de biyo-enerjisistemlerinde elde edilen redüklenme miktarından daha yüksek bulunmuştur. Busonuç, AuBP2 gibi çok küçük bir molekül ile yüzeye tutturulan enzimin, elektrodayakınlığı sonucunda elektrod ile enzim arasındaki elektron transferine olanaksağlandığını düşündürmüştür.Tez çalışması genel olarak incelendiğinde altına özgün bağlanan peptidlerin hemprotein hem de enzim immobilzasyonunda etkin olarak kullanılabileceğigörülmüştür. GEPI aracılıklı immobilizasyon ile huntington hastalığı gibi proteinagregasyonuna dayalı diğer nörodejeneratif hastalıkların da çalışılması mümkündür.Ayrıca sensör yüzeyine yaklaştırılmak istenen enzimlerin GEPI aracılıklıimmobilizasyon ile yüzeye tutuklanmaları olanağı vardır.

Nature provides enormous structures exhibiting great functions such as strength,optical and magnetic properties. The molecular hierarchy of these structures arisesfrom the hybrid organic-inorganic interfaces. The organic compounds are mainlyproteins, which are mediating the assembly of inorganic molecules for orderedstructures. The protein moieties interacting with the inorganic molecules could bepurified and utilized for biotechnological applications in order to obtain newgeneration biomaterials. However, the purification of the proteins from hard tissuesis time consuming as well as the natural proteins may not even exist for some of thetechnologically relevant materials. Therefore, combinatorial biology techniques havebeen adapted and applied in the last decade for the selection of inorganic bindingpeptides for desired inorganic materials. The inorganic binding peptides selected andfurther characterized by Sarikaya and Tamerler group was named as GEPIs(Genetically Engineered Peptides for Inorganics) and this term is widely used in theliterature. In the last decade, inorganic binding peptides have been selected forvarious inorganic materials by our group and others. In the last years GEPIs weredemonstrated to exhibit a number of functions such as linking inorganic-inorganicparticles, synthesizing inorganic materials and immobilizing biomolecules oninorganic surfaces through their controlled interactions at the biological-materialinterface based on molecular recognition. In this study, our purpose to develop fusionproteins incorporating inorganic binding domain and demonstrate their versatile usein a wide range of area from biomedical to biotechnology. We utilized two of theinorganic gold binding peptides, with different length and binding characteristics fordirected immobilization of Huntingtin protein, which is responsible for Huntingtondisease, and Lactate dehydrogenase, which is an important enzyme in chemical andpharmaceutical industriesIn the biomedical studies related part of our study, one of the gold binding peptides(GBP1: MHGKTQATSGTIQS) was used as fusion partner with Huntingtin protein(Htt) to mediate its directed immobilization onto gold surface. Htt is a eukaryoticprotein, which is causing to Huntington?s disease in mutated form. The mainpathology of the disease is the inclusion bodies found in cytoplasm and nucleus,which are composed of aggregated Htt proteins. Therefore, investigating theaggregation profile of the protein is critical and expected to have an impact on theprogress of the disease. In order to investigate aggregation kinetics, we utilized SPR,which is a surface based system. Preformed fibrils composed of mutant Htt proteinswere immobilized on gold sensor surface with the gold binding ability of the fusionpartner GBP1. Two different stages of fibrillization were monitored which are fibriland proto-fibril elongations. The data obtained for fibril elongation was suggested atwo-stage model indicating the interaction of monomer to fibril in the first stage and the conformational change of newly added monomer in the second stage. In theproto-fibril elongation, a one-stage model was proposed indicating the addition ofmonomer to the fibril. Difference between the first stage KD values of two individualsteps showed that fibril elongation is slower in the early times of fibrillization whichincreases while the fibril is formed. The obtained fibrillization kinetics lead for thedetection of the effect of new drug targets either for preventing or inducingaggreagation. Our studies demonstrate that the GBP1 mediated immobilization couldbe utilized for the investigation of aggregation kinetics for other neurodegenerativediseases as well through the attaching the proteins to the electrode surfaces with anorientation control and following the interaction with the counterparts dynamically.In the second part of our study, we used another gold binding peptide AuBP2, whichis much smaller than GBP, as the fusion partner for Bacillus stearothermophilusLDH (bsLDH). The AuBP2 link was utilized to provide to direct LDH?simmobilization onto gold surface with an orientation control and result in self-organization of the fusion product. bsLDH is a consumable enzyme in food,chemical and pharmaceutical industries and it is therefore industrially an importantenzyme. Additionaly, enzyme based biosensors for lactate detection is required LDHutilization. Finally, as being a redox enzyme, LDH has application area in biofuellcell systems, which has getting increasing interest in the recent years. However, theenzyme has to be immobilized without catalytic activity loss which requiresorientation control at the close proximity to increase the efficiency for both biosensorand biofuell cell applications. In consequence of reduced retained activities andefficiencies in electron circulation due to conventional surface immobilizationtechniques, we utilized GEPI mediated immobilization for LDH attachment ontogold surfaces. AuBP2 peptide region was genetically fused to the N-terminal of theenzyme. Enzyme activity analysis of the fusion construct indicated that AuBP2insertion doesn?t effect the enzyme activity. On the other hand, gold binding kineticsof fusion construct concluded that AuBP2 insertion resulted in gold binding ability toLDH enzyme. As expected, the immobilized enzyme was still keeping its activity.Even, at the end of the 30th day, the relative activity of the immobilized enzyme wasabout %100 compared to free enzyme. Finally, redox catalysis efficiency of theenzyme was investigated by using cyclic voltammetry. The data enabled thedetection of reducing reaction catalysed by LDH, in correlation with increasingsubstrate concentration. These data together provides that LDH immobilized byAuBP2 could be used for biosensor and biofuell cell applications.Overall, our results demonstrate that inorganic binding peptides are new type ofsurface functionalization linkers that provide functional biomolecules, ie. proteinsand enzymes to be immobilized on the desired surfaces with orientation control at aclose proximity through self assembly of the fusion molecules. This self-organizationhas potential in diverse technological areas from monitoring to energy conversion.