Pı3k/ Akt Sinyal İleti Yolağının Pediatrik Akut Myeloid Lösemideki Regülasyonu: Yeni Bir Tümör Baskılayıcı Gen Phlpp

Abstract

Upregüle edilmiş fosfoinositid-3-kinaz (PI3K)/Akt yolağının, Akut Myeloid Lösemi (AML) patogenezinde ve hastalığın ilerlemesinde rol oynadığı bilinmektedir. Akt sinyal ileti yolunun terminasyonu PTEN ve PHLPP proteinleri ile kontrol edilir. PHLPP; amino-terminal PH bölgesi, lösin yönünden zengin tekrar bölgesi (LRR), PP2C-benzeri katalitik merkez ve PDZ bağlanma bölgesi olmak üzere dört temel fonksiyonel bölge içerir. Fonksiyonel PHLPP gen bölgelerine ait varyasyon ve PI3K/Akt sinyal ileti yolağı genlerinden; Akt-1, PTEN ve kaspaz-3 genleri ile beraber ekspresyon analizi yapılmıştır. Dört temel bölgeyi kodlayan 11 ekzonun pediyatrik AML hastasındaki mutasyon taraması DHPLC analizi ve direkt dizileme yöntemi ile gerçekleştirilmiş, çeşitli varyasyonlar bulunmuştur. Ekspresyon çalışmaları pediyatrik AML hastalarında ve sağlıklı bireylere ait CD33+ kemik iliği hücrelerinde qRT-PCR yöntemi ile gerçekleştirilmiştir. Hasta grubunda Akt sinyal ileti yolağının upregüle olduğu, PTEN, PHLPP ve kaspaz-3’ün ekspresyonlarının ise azaldığı (sırasıyla 3 kat, 10 kat ve 3 kat) görülmüştür. PH, PP2C-benzeri katalitik merkez ve PDZ bağlanma bölgelerinin ekspresyonlarının görülmesine rağmen LRR bölgesinin ekspresyonu hastalarda gözlemlenmemiştir. LRR bölgesi ekspresyonunun görülmediği hasta örneklerinde üç farklı transkript varyantı tespit edilmiştir. PHLPP bölgelerinin ekspresyonuna farklı tümör dokularında bakılması sonucu, LRR bölgesi ve PP2C-benzeri katalitik merkez ekspresyonlarının olmadığı görülmüştür. Pediatrik AML hasta örnekleriyle gerçekleştirilmiş ekspresyon çalışmalarının sonuçlarından farklı olarak, PHLPP’nin PP2C-benzeri katalitik bölgesinin ekspresyonunun tümör dokularında olmadığı bulunmuştur. Western blot analizi sonuçları da eksiksiz PHLPP ekspresyonunun her iki çalışma grubunda da olmadığını göstererek gen ekspresyon çalışma sonuçlarını konfirme etmiştir. Bu çalışma, PHLPP geninin sekans varyasyonlarının ve beraberinde ekspresyon seviyelerinin araştırıldığı ilk çalışmadır. Çalışmanın sonuçları, PHLPP geninin AML lökomogenezinde ve tümörigenezde bir tümör supressör olarak rol oynayabileceğini düşündürmektedir.

Upregulated PI3K/Akt pathway has been implicated in both pathogenesis and progression of Acute Myeloid Leukemia (AML). Two key proteins control the termination of Akt signaling: PTEN, and PH domain and leucine rich repeat protein phosphatase, PHLPP. Human PHLPP contains four major functional domains; an amino-terminal PH domain, a leucine-rich repeat region (LRR), a PP2C-like catalytic core and a PDZ binding motif. Variations in coding regions and the expression of PHLPP gene functional domains together with PI3K/Akt pathway genes; Akt-1, PTEN and caspase-3 were examined. 11 exons covering the four domains of PHLPP were screened by DHPLC analysis and the results were confirmed by direct sequencing. Various sequence variations were determined. The expression studies performed in pediatric AML patients and in CD33+ healthy bone marrow cells by qRT-PCR revealed that Akt was up-regulated, whereas PTEN, PHLPP and caspase-3 expressions were decreased (3 times, 10 times and 3 times respectively). Although the expression of LRR domain was lost, PH, PP2C-like catalytic core and PDZ binding domains expressions were detected. In pediatric AML samples lacking LRR domain expression, three different transcript variants were identified. Expression studies of PHLPP domains in various tumour tissues revealed the loss of LRR domain and PP2C like catalytic core. Western blot analysis results also confirmed the loss of intact PHLPP expression in both study groups. This is the first study evaluating sequence variations together with the expression of PHLPP functional domains. Taking all together, PHLPP gene might act as a tumour suppressor in AML leukomogenesis and tumorigenesis.