Inverse metabolic engineering and molecular characterization of caffeine-resistant saccharomcyes cerevisiae

Abstract

Caffeine, a natural purine alkaloid, is highly consumed worldwide as an ingredient of some beverages like coffee, tea and soft drinks. Although there are many reports on caffeine effects in many organisms like yeast, pleiotropic effects of caffeine, and molecular mechanisms of caffeine resistance and response are largely unknown.In this study, highly caffeine-resistant Saccharomyces cerevisiae mutants were obtained for the first time by evolutionary engineering, an inverse metabolic engineering strategy, based on batch selection under gradually increasing caffeine stress, with and without applying any mutagen to the initial population before selection. The selection process was initiated at 7.5 mM caffeine concentration, and continued until 50 mM, for 48 populations. Genetically stable, caffeine-resistant mutant strains were isolated from the final populations of the selection, where they resisted as high as 50 mM caffeine, a concentration that has not been documented for S. cerevisiae so far. Among those mutants, three strains Caf905-2, Caf906-11, and Caf906-12) had the highest caffeine resistance, and they were also cross-resistant to a variety of stress conditions like coniferyl aldehyde, antimycin A, and rapamycin. One of the caffeine-hyperresistant strains (Caf905-2) was characterized at physiological, transcriptomic and genomic levels. Caf905-2 did not have a reduction of growth under 10 mM caffeine stress, where its maximum specific growth rate (µmax) was nearly three-fold of that of the reference strain. Expectedly, Caf905-2 entered the stationary phase at 12 h, but the reference strain at 30 h. Biomass levels of the two strains showed an increase under 10 mM caffeine stress, compared to the absence of caffeine. Also, ethanol yield decreased in the reference strain under 10 mM caffeine stress, but not in Caf905-2. Similarly, glycerol yield decreased in Caf905-2 under caffeine stress, but not in the reference strain. The reference strain also accumulated more intracellular trehalose than Caf905-2, particularly under caffeine stress condition. The resistance of Caf905-2 against lyticase, a β-1,3-glucan-degrading enzyme, was higher than that of the reference strain, under both caffeine stress and nonstress conditions. DNA microarray analysis identified a total of 745 overexpressed and 741 repressed genes with statistically changes of gene expression levels (corrected p < 0.05) encompassing at least 2-fold alteration in Caf905-2. Functional categorization of transcriptomic analysis results of Caf905-2 suggested that the genes implicated in energy and protein fate pathways, oxygen and radical detoxification, and drug/toxin transport associated with pleiotropic drug resistance were stimulated, whereas the genes implicated in transcription, protein synthesis, cellular transport pathways, and nucleotide metabolism were repressed in the nonstress condition. Whole genome re-sequencing analysis results unearthed only three single nucleotide variations, distributed in three different genes; PDR1, PDR5, and RIM8 in Caf905-2, relative to the reference strain. The exact roles of these genes in caffeine response and resistance in yeast should be investigated in detail in future studies.

Kafein, doğal bir pürin alkaloid olup, dünya genelinde çok sayıda insan tarafından çoğunlukla kahve, çay ve enerji içeceklerinin bir bileşeni olarak tüketilmektedir. Kafeinin, mayanın da içinde olduğu birçok organizma üzerindeki etkisi ile ilgili çok sayıda bilimsel veri olmasına karşın, kafein yanıtının ve dirençliliğinin karmaşık moleküler mekanizması ve pleiotropik etkisi hala büyük ölçüde bilinmemektedir. Bu çalışmada, yüksek düzeyde kafeine dirençli ve genetik olarak kararlı olan üç adet Saccharomyces cerevisiae mutantı, ilk kez, kesikli kültürde seleksiyon işlemine dayalı bir strateji olan evrimsel mühendislik yoluyla, seçilim öncesinde bir başlangıç popülasyonu olarak herhangi bir mutajen kullanarak ve kullanmayarak, gittikçe artan kafein stres konsantrasyonu varlığında geliştirildi. Seçilim süreci, 7.5 mM kafein konsantrasyonu ile başlatıldı ve kafein düzeyi 50 mM'a ulaştığında sonlandırıldı. Seçilim süreci sonunda, 48 popülasyon elde edildi. EMS (etilmetan sülfonat) mutajeni ile elde edilen populasyon ve mutajene maruz bırakılmayan referans suş kullanılarak başlatılan seçilim süreci, 50 mM kafeine dirençli iki ayrı popülasyon olarak noktalandırıldı. Bu gelinen son konsantrasyonda (50 mM), başlangıçta seçilim süreci için kullanılan EMS'ye maruz bırakılmış populasyon ile referans suş gelişme göstermezken, bu başlangıç populasyonlarından elde edilen son popülasyonlar ise yaklaşık olarak %60 oranında sağkalım oranına sahip olmuşlardır. Genetik olarak kararlı olan ve kafeine dirençli mutant suşlar, S. cerevisiae için literatürde yer almayacak düzeyde yüksek kafein (50 mM) varlığında, seçilim süreci sonunda elde edilen son populasyonlarından izole edilmiştir. Kantitatif bir yöntem olan 5-tüplü En Muhtemel Sayı Yöntemi ile 15 mM kafein varlığında, 24, 48 ve 72 saatler sonunda en iyi gelişebilen kafeine dirençli üç suş (Caf905-2, Caf906-11, and Caf906-12), sonraki deneysel analizler için seçilerek analiz edilmiştir. Bu üç suş, kafeinin yanı sıra, koniferil aldehit, antimisin A, propolis ve rapamisin gibi çeşitli bileşiklere karşı çapraz direnç göstermiştir. Sonrasında, kafeine yüksek direnç gösteren Caf905-2 suşu, daha ileri fizyolojik, genomik ve transkriptomik karakterizasyonlar için seçilerek incelenmiştir. Kafeine yüksek direnç gösteren Caf905-2, konferil aldehit, rapamisin ve antimisin A'nın yanı sıra, dimetilsülfoksite (DMSO) ve özellikle siklohekzimide karşı yüksek düzeyde çapraz direnç sergilemiştir. Kafeine dirençli Caf905-2 ayrıca, hemen hemen test edilen bütün ağır metallerin yanı sıra, etanol, 2-feniletanol, tuz, glifosat, hidrojen peroksit, ısı, ve alkali pH streslerine karşı farklı düzeylerde duyarlılık sergilemiştir. Referans suştan farklı olarak, kafeine yüksek düzeyde direnç gösteren Caf905-2, 10 mM kafein stresi varlığında, gelişme hızında bir düşüş sergilemezken, referans suşun gelişme hızı önemli ölçüde düşmüştür: Caf905-2'nin maksimum spesifik gelişme hızı (µmax), referans suşun maksimum spesifik gelişme hızına kıyasla yaklaşık olarak üç kat fazladır. Kafeine yüksek düzeyde direnç sergileyen Caf905-2, gelişme eğrisinin logaritmik gelişme fazının başlangıcından yaklaşık 12 saat sonra durağan fazına girmişken, referans suş ise durağan faza 30 saat sonra girebilmiştir. Ayrıca, hem referans suşun hem de kafeine yüksek düzeyde direnç gösteren Caf905-2'nin biyokütle veriminde, 10 mM kafein stresi altında, kafeinin olmadığı ortama nazaran önemli bir artış gözlemlenmiştir. Buna ilaveten, referans suşun üretmiş olduğu etanolün veriminde, 10 mM kafein stresi varlığında, kafeinsiz ortama nazaran, bir düşüş olmasına karşın, kafeine yüksek düzeyde direnç gösteren Caf905-2'nin etanol veriminde bir değişiklik gözlemlenmemiştir. Gliserol veriminde ise, etanol veriminin aksine, kafein stresi altında, kafeine yüksek düzeyde direnç gösteren Caf905-2'de bir düşüş görülürken, referans suşta bir değişiklik gözlemlenmemiştir. Bunların yanı sıra, referans suş, gerek kafein stresinin olmadığı ortamda, gerekse de özellikle 10 mM kafein stresi varlığında, kafeine yüksek düzeyde direnç gösteren Caf905-2 suşuna nazaran, hücre içi trehalozu daha yüksek düzeyde birikmiştir. β-1,3-glucan'ın parçalanmasından sorumlu bir enzim olan litikaza karşı referans suşun ve kafeine yüksek direnç gösteren Caf905-2'nin duyarlılık düzeyi birbirinden farklılık göstermektedir. Buna göre, kafeine dirençli Caf905-2'nin, referans suşa nazaran, kafeinin olmadığı stressiz koşulda litikaza karşı daha dirençli olduğu gözlemlenmiştir. Ancak kafein, referans suşun litikaza karşı duyarlılığını ortadan kaldırarak referans suşu, Caf905-2 suşunun litikaza karşı dirençliliğine benzer bir seviyeye taşımıştır. DNA mikrodizin analizine dayanan gen anlatım analiz sonuçları, kafeine yüksek düzeyde direnç sergileyen Caf905-2 suşunda, istatistiksel olarak anlamlı olan (doğrulanmış p < 0.05) en az iki kat değişiklikle 745 genin anlatım düzeyinde artış gözlemlenirken, 741 genin anlatımında ise düşüş olduğunu göstermiştir. Bu şekilde toplamda 1489 gende, farklı düzeylerde değişiklikler meydana gelmiştir. Kafeine yüksek düzeyde dirençli suş olan Caf905-2'nin transkriptomik analizinin işlevsel gruplandırılmasına göre, karbonhidrat ve ikincil metabolizma gruplarını içeren metabolizma, enerji, protein akibeti (fate), protein bağlanma işlevi ve hücre savunma virülans ana grupları ile ilişkili genler, kafein içermeyen stressiz koşullarda uyarılmışlardır. Bu ana işlevsel grupların altında, glikoliz ve glukoneojenez, pentoz fosfat sinyal yolağı (PPP), elektron taşıma sistemi ve zar bağlantılı enerji korunumu, enerji rezervlerinin (trehaloz, glikojen vb.) metabolizması, protein katlanması ve stabilizasyonu, oksijen ve radikal detoksifikasyonu alt grupları yer alır ve bunlar en az iki kat artmıştır. Bunun yanında, nükleotit ve amino asit metabolizmalarını içeren metabolizma, transkripsiyon, protein sentezi, protein bağlanma işlevi, ve hücre içi taşıma ana kategorileri ile ilişkili genler ise, yine kafein içermeyen stressiz koşulda baskılanmışlardır. Baskılanan genlerin içinde yer aldığı işlevsel grupların altında, pürin ve pirimidin metabolizması, RNA işlenmesi ve modifikasyonu, ribozom biyojenezi, translasyon, translasyonel kontrol, aminoaçil- tRNA-sentaz, RNA bağlanması, ağır metal iyon taşıması (Cu+, Fe3+, vb.), amin/poliamin taşıması, nükleotit taşıması, vitamin/kofaktör taşınması, taşıma vasıtaları alt grupları yer almaktadır ve bunlar da az iki kat zenginleştirilmişlerdir. Bunların yanı sıra, bu kategoriler içerisinde yer almayıp, bu çalışma için önemleri tüm genom tekrar dizileme analiz sonucunda ortaya çıkan genler, pleiotropik ilaç direnci ile ilişkili genlerdir ve ilaç/toksin taşıma kategorisinde yer almışlardır. Referans suş ile kıyaslamalı olarak elde edilen tüm genom dizileme analiz sonuçları, kafeine yüksek düzeyde dirençli Caf905-2 suşunda, yalnızca üç tane tek nükleotit varyasyonu (SNV) olduğunu ortaya çıkarmıştır. Bu SNV'lerin ise PDR1, PDR5 ve RIM8 adlı üç farklı gende oldukları görülmüştür. PDR1 geninde A2456T, PDR5 geninde G2008T ve RIM8 geninde A1097G şeklinde SNV'ler mevcuttur ve bu SNV'ler, sırasıyla V819D, A670S ve Q366R amino asit değişikliklerine karşılık gelmektedir. Yapılacak ilerki çalışmalar ile, bu genlerin mayadaki kafein tepki ve direnç mekanizmasındaki rollerinin detaylı olarak incelenmesi uygun olacaktır.