Gelişimsel Süreçte Katanin P60, P80 Ve Spastin Proteinlerinin Ekspresyonlarının Tayini

Abstract

Ökaryotik hücreler, hücre döngüsü, büyüme, farklılaşma ve hücre göçü gibi faaliyetleri boyunca mikrotubul hücre iskeletlerini hızlı bir şekilde organize ederler. Hücrenin bu gibi fonksiyonları, mikrotubul ağının dinamizmi ile sağlanmaktadır. Evrimsel olarak korunmuş AAA (ATPases Associated with diverse cellular Activities) ATPaz ailesine mensup katanin ve spastin proteinleri hücre iskeletinin düzenlenmesinden sorumlu mikrotubul-ilişkili (microtubul-interacting) proteinler olup, dinamikliğinin oluşması için başlıca öneme sahiptir. Katanin 60 ve 80 kD’luk iki alt üniteden oluşan heterodimerik bir proteindir. Bu alt üniteler büyüklükleri doğrultusunda katanin p60 ve katanin p80 olarak adlandırılmaktadır. p60 alt ünitesinin ATP hidrolizi ile enzimatik aktivite gösteren, mikrotubul depolimerizasyonunu sağlayan parça olduğu, p80’in ise katanine yön veren düzenleyici parça olduğu düşünülmektedir. Yapılan çalışmalar, proteine ait bu iki altünitenin farklı dokularda, hatta nöronun farklı bölgelerinde dahi farklı konsantrasyonlarda bulunabildiğini göstermiştir. Spastin ise, kalıtsal spastik parapleji rahatsızlığı ile ilişkilendirilen ve fiziksel olarak katanin p60 alt ünitesine benzerlik gösteren bir başka mikrotubul kesici proteindir. Bu çalışmanın amacı, katanin ve spastinin, gelişimsel süreçte, mitotik ve post-mitotik dokulardaki ekspresyonunun RNA ve protein düzeyinde tayin edilmesidir. Bu amaçla Gallus gallus embriyosu üzerinde in situ hibridizasyon ve buna ek olarak da immunohistokimya uygulamaları yapılmıştır. In situ hibridizasyon için kullanılacak olan riboproblar, daha önceki çalışmalarda elde edilmiş Gallus gallus’a ait katanin p60, katanin p80 ve spastin cDNA’ları üzerinden DIG-RNA labelling kit ile transkripsiyon yapılarak üretildi. Kuluçka makinesinde inkübe edilen döllenmiş tavuk yumurtaları ile 5 ve 7 günlük dönemlerde diseksiyon yapılarak cryostat ile kesit alındı. Kesitlere katanin p60, katanin p80 ve spastin için in situ hibridizasyon ve immunohistokimya uygulanıp ışık mikroskobuyla görüntülendi. In situ hibridizasyon çalışmasından elde edilen sonuçlar katanin p60, p80 ve spastin’in omurilikte, somitlerde, notokordda, beyinde ve retinada eksprese edildiğini göstermektedir. Üç proteinin ekspresyon paterni benzemekle beraber, katanin p80 için elde edilen görüntülerde renk kontrastı daha belirgin olduğundan katanin p80’in ekspresyonunun daha fazla olduğu düşünülmüştür. Immunohistokimya uygulaması katanin p80 ve spastin için sonuç vermezken katanin p60 için in situ hibridazyon sonuçlarını doğrular niteliktedir.Eukaryotic cells organize their microtubule structured cytoskeleton rapidly, during cellular functions such as; cell cycle, growth, differentiation and cell migration. These functions of cells are supplied by dynamics of microtubule network. Evolutionary conserved AAA (ATPases Associated with diverse cellular Activities) family proteins katanin and spastin are microtubule-interacting proteins which are responsible from regulation of cytoskeleton dynamic. Katanin is a heterodimeric protein which consists of 60 and 80 kD subunits. These subunits are named as katanin p60 and katanin p80 according to their molecular weight. It is thought that p60 shows the enzymatic activity with ATP hydolysis and depolymerizes the microtubule, while p80 directs and regulates the activity of katanin. Studies show that two subunits are found with different concentrations in different tissues even in different sites of a neuron. On the other hand, spastin is another microtubule-severing protein which resembles like to katanin p60, and is related to hereditary spastic paraplegia. Aim of the project is to determine microtubule-severing proteins katanin and spastin expression in mitotic and post mitotic tissues at developmental stage. For this purpose, in situ hybridization and immunohistochemistry techniques were applied with Gallus gallus embryos. Riboprobes for in situ hybridization were produced from the cDNA’s of Gallus gallus katanin p60, katanin p80 and spastin by transcription with DIG-RNA labelling kit. Sections were taken by cryostat, from the fertilized chicken eggs which were incubated up to 5 and 7 days. In situ hybridization and immunohistochemistry were applied for katanin p60, katanin p80 and spastin on sections. Then, samples were visiualized by light microscope. The results from the in situ hybridization indicates the presence of expression of katanin p60, katanin p80 and spastin on spinal cord, somites, notochord, brain and retina. The expression pattern of three proteins are similar, katanin p80 samples show a better colour contrast; so, it is observed that katanin p80 expression is higher on these tissues. While immunohistochemistry application is ineffective for katanin p80 and spastin, it supports the results of in situ hybridization for katanin p60.