Katanin P80 Geninin Promotor Elementlerinin Analizi

Abstract

Katanin 60 kDa (p60) ve 80 kDa (p80) büyüklüğünde iki alt üniteden oluşan ve ATP hidrolizleyerek mikrotubulleri parçalayan bir proteindir. KATNA1 geni tarafından kodlanan p60 alt ünitesi enzim aktivitesi ile mikrotubulleri keserken, KATNB1 geni tarafından kodlanan p80 alt ünitesi enzimin hücre içindeki lokalizasyonunda görevlidir. Bu çalışma ile KATNB1 geninin promotorundaki nükleotid dizisinin karakterizasyonu ve promotor bölgesindeki transkripsiyon faktör bağlanma bölgelerinin aydınlatılması amaçlanmıştır. Çalışmada, promotor bölgesinin karakterizasyonu için polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ile KATNB1 geninin 1000 baz öncesinden başlanarak delesyon konstraktları hazırlanmış ve uygun primerler ile nested PZR tekniği uygulanarak daha kısa parçalar elde edilmiştir. Bu diziler promotor içermeyen fakat raportör (bildirici) bir gen (lusiferaz) içeren bir plazmit vektöre klonlanmıştır. Promotor bölgenin fonksiyonel analizi için bu konstraktların insan nöroblastoma hücrelerine transferiyle gen ekspresyonu üzerindeki etkilerinin incelenmesinde lusiferaz enziminin katalitik aktivitesinden yararlanılmıştır. 518 bp’lik TATA-sız promotorun yüksek seviyede promotor aktivitesi için yeterli olduğu gösterilmiştir. Promotor bölgenin Elk-1 transkripsiyon faktörü tarafından baskılandığı, PEA3 transkripsiyon faktörünün ise promotor bölge üzerinde etkisinin olmadığı gösterilmiştir.

Katanin is a heterodimeric protein that severes microtubules by hydrolyzing ATP. Katanin consists of 60 kDa and 80 kDa polypeptides. 60 kDa subunit coded from KATNA1 gene, has the enzymatic activity to break microtubules, whereas 80 kDa subunit coded from KATNB1 gene, has a role in localization of the protein complex in the cell. In this study, we set out sight on the identification of promoter site and transcription factor binding sites of KATNB1 promoter. For characterization of promoter of KATNB1 gene, polymerase chain reaction (PCR) is used to amplify 1000 bp upstream nucleotides of KATNB1 gene. By using internal primers and nested PCR technique shorter fragments are obtained. These promoter deletion constructs are cloned into a luciferase reporter plasmid vector which lacks eukaryotic promoter and enhancer sequences. We took advantage of the luciferase assay system for functional analysis of the promoter by transfecting neuroblastoma cells with these constructs and the effects of promoter parts on katanin expression is examined. 518 bp TATA-less promoter was found to be sufficient for high levels of activity. Overexpression of Elk-1 transcription factor caused the repression of the promoter whereas overexpresion of PEA3 transcription factor had no effect on promoter activity.