İn Vivo Evrimsel Mühendislik Yöntemi İle Ticari Bir Maya Suşunun Etanol Direncinin Geliştirilmesi

Abstract

Yapılan çalışmanın amacı, evrimsel mühendislik stratejisi kullanılarak etanole dirençli Saccharomyces cerevisiae hücreleri elde etmektir. Bu amaçla yaban tip suş (Hef) rastgele mutasyona uğramış (Hef1) popülasyonunu elde etmek amacıyla kimyasal mutajen etil metan sülfonat’a maruz bırakılmıştır. Etanole dirençli bireylerin seçiminde genetik çeşitliliği olan Hef1 populasyonu kullanılmıştır. Sürekli stres seçilim stratejisi geliştirilmiştir. Sürekli stres seçilim stratejisi kültürü strese sürekli maruz bırakarak o stres seviyesine dayanıklı bireyleri elde etme temeline dayanmaktadır. Hayatta kalmayı başarabilen bireylerin metabolizmalarını yüksek stres seviyelerine adapte olmaya eğilimli genetik diziye sahip olmaları beklenir. İlk nesilde hayatta kalmayı başarabilen bireyler bir sonraki stres seleksiyon basamağına geçerler ve stres seviyesi bir sonraki basamakta arttırılır. Başlangıç etanol konsantrasyonunu ve artış aralığını belirlemek amacıyla tarama prosedürü gerçekleştirilmiştir. Tarama sonuçlarına göre başlangıç stres seviyesi için 10 % etanol (v/v) ve artış aralığı için 0.1% etanol (v/v) olmasına karar verilmiştir. Sürekli stres seleksiyon stratejisi ile 28 nesil elde edilmiştir. Seleksiyon stratejisi için 10 farklı birey seçilmiştir. Seçilen bireylere tarama prosedürü, etanole dirençliliklerini ölçmek amacıyla tekrar uygulanmıştır. Mutant 11’in etanole karşı daha fazla direnç geliştirdiği görülmüştür. 6, 8, 11, ve 12 mutantlarının farklı birçok strese çapraz dirençlilikleri en muhtemel sayı metoduyla (MPN) tespit edilmiştir. Sürekli stres seçilim yöntemi ile elde edilen bireylerin metal, sorbitol, yüksek sıcaklık, ozmotik, donma-erime, ve hacmen %20 etanol ani şok stresine çapraz direnç gösterdiği gözlemlenmiştir. Sonuç olarak evrimsel mühendislik yöntemi ile etanole dirençli bireyler elde edilmiştir. İleriki çalışmalarda da etanol direnç mekanizmasının ve bunun diğer stres faktörleri ile ilişkisini anlamak üzere detaylı transkriptomik ve proteomik analizlerin yapılması.

The aim of the present study was to obtain ethanol resistant commercial yeast strain (Saccharomyces cerevisiae) cells by using evolutionary engineering strategy. For this purpose wild type (Hef) strain was exposed to a chemical mutagen Ethyl methane-sulfonate in order to obtain a randomly mutagenized population (Hef1). Genetically diverse population (Hef1) was used to select the ethanol resistant individuals. Continuous selection strategies were designed. The stress levels were increased for each successive generation of selection stress. A screening procedure was applied in order to detect the initial ethanol stress level. Depending on the screening results, 10 % ethanol (v/v) for the initial stress level with a 0.1 % increasing range for both selection strategies were determined. Twenty eight generations were obtained with continuous stress selection strategy. Ten different individuals were selected. A screening procedure was applied to individuals in order to determine the ethanol resistence. Mutant 11 was more resistant to ethanol. Cross-resistance to several different stresses of four mutants 6, 8, 11 and 12 were determined by using most probable number (MPN) method. Mutants obtained from continuous selection strategy had cross resistance to metal, sorbitol, heat, osmotic, freezing-thawing, 20 % ethanol pulse stresses. To summarize, by applying evolutionary engineering, ethanol resistant individuals were successfully obtained. In order to understand the mechanism of ethanol resistance and relationship with stress factors, detailed transcriptomic and proteomic analyses would be necessary for future studies.