Katanin P60 Proteini İle Etkileşen Proteinlerin Belirlenmesi

Abstract

Katanin mikrotubul kesme özelliği ile hücre iskeleti dinamiğinde önemli görevlere sahiptir. Uzun mikrotubuller hareketsiz iken katanin tarafından kesilip küçük parçalara ayrılan mikrotubuller hareketlilik kazanırlar ve böylelikle hücre iskeleti organizasyonlarına katılabilirler. Bu kısa ve hareketli mikrotubuller, yeni nörit oluşumunda kullanılmaları bakımından özellikle nöronlar için son derece önemlidirler. Katanin, p60 katalitik ve p80 düzenleyici olmak üzere iki alt birime sahiptir. p60, p80 tarafından yönlendirildiği sentrozomlarda altılı bir yapı oluşturup, ATP hidroliziyle mikrotubulu keser. Ancak katanin p60 alt biriminin p80 alt biriminden farklı bir protein ile etkileşimi henüz gösterilmemiştir. Bu nedenle çalışmanın amacı katanin p60 ile etkileşime giren proteinlerin aydınlatılması olarak belirlenmiştir. Yeni protein etkileşimlerinin aydınlatılması için cDNA havuz çalışmalarda kullanılabilecek en iyi yöntem olan maya ikili hibrid sistemi kullanılmıştır. Etkileşime girecek olan proteinler insan embriyonik beyin cDNA kütüphanesinden seçilmiştir. Katanin p60 geni işaretçi gen transkripsiyon faktörünün DNA dizisine bağlandığı alt birimle birleştirilmiştir. P60’ın etkileşebileceği olası genleri içeren kütüphane de transkripsiyon faktörünün aktivasyon alt birimiyle birleştirilmiştir. Her bir plazmid farklı çiftleşme tipine sahip mayalara (S. cerevisiae) yerleştirildikten sonra bu suşların çiftleşmesi sağlanmıştır. Oluşan diploit mayalar, işaretçi genin aktivasyonu ile seçilmiştir. Mayaların çiftleşmesi sonucunda p60 ile etkileşen 22 proteinin etkileşimi doğrulanmıştır. Katanin mikrotubul kesme özelliği ile mikrotubul dinamiği ve hücre iskeleti oluşumunda önemlidir. Bu sebeple katanin p60 ile etkileşime giren proteinlerin aydınlatılması, kataninin bu proteinlerle etkileşmesi sonucu sinir hücresi içindeki olası diğer rollerinin ortaya çıkartılması açısından sinir bilimi literatürü için çok önemlidir.

Katanin has important functions in cytoskeletal dynamics through its microtubule severing activity. Long microtubules are stationary, whereas short microtubule fragments severed via katanin achieve motility and could contribute into cytoskeletal organizations. These short and motile microtubules are especially essential for neuronal branching. Katanin protein consists of two domains; p60 catalytic domain and p80 regulatory domain. P80 directs p60 to the centrosomes where p60 forms hexameric structure and severs microtubule by ATP hydrolysis. Nevertheless, there is no identified interaction of katanin with any protein except p80. Thus, purpose of this study was to identify katanin p60 interacting proteins in neuronal cells. In this study Yeast Two Hybrid System, which is the best method for detection of novel protein interactions from cDNA pool, was chosen for identification of new katanin p60 interacting proteins. “Clontech Matchmaker Yeast Two Hybrid” kit was used for this study and new interacting proteins were selected from fetal human brain cDNA library. Katanin p60 gene was fused with DNA binding domain of transcription factor of reporter gene and cDNA library was fused with activation domain of the same transcription factor. Each fusion construct was inserted into different mating types of S. cerevisiae and strains were mated. Following mating, diploid yeast cells were selected through reporter gene activation. 22 new protein interactions were identified and confirmed. Katanin is a critical protein in microtubule dynamics and has roles in many important cellular activities. Therefore, elucidation of katanin p60 interacting proteins, revealing possible diverse roles of katanin in neurons through discovered interactions would provide significant data for neuroscience literature.