A novel rotationally oscillating micro drill for microinjection operations

dc.contributor.advisor Ergenç, Ali Fuat
dc.contributor.advisor Geçtiğimiz yüzyılın başında Dr. Marshall A. Barber tarafından geliştirilen mikromanipülasyon ve mikroenjeksiyon teknikleri yaşam bilimlerinde vazgeçilmez ve ideal bir araç haline geldi. Bakteriyoloji bilimcisi Barber'ın bakteri hücrelerini izole etmek için geliştirdiği "pipet yöntemi", bir bileşik mikroskop ile canlı hücreyi görselleştirip mikropipet tutucuyu hareket ettiren manuel bir mikromanipülatör ile ince uçlu cam bir mikropipetin hücre içine girmesini sağladı. Bu tarihten itibaren yüzyıl boyunca mikroenjeksiyon yöntemi çeşitli modifikasyonlarla geliştirildi ve üreme biyolojisi kapsamında intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu, çekirdek DNA enjeksiyonu, transgenik hayvan çalışmaları, gen hedefleme çalışmaları, kök hücre araştırmaları ve klonlama çalışmalarını kapsayan geniş bir alanda kullanılmaya başlandı. Bu çalışmaların özünde tek hücre üzerinde mikroskopik seviyede yapılan operasyonlar ile hücreler arası çekirdek transferleri ve genetik materyal enjeksiyonları bulunmaktadır. Mikroenjeksiyon işlemi mikroskop altında camdan yapılmış çok ince bir kılcal mikropipet ile hareketsiz hale getirilmiş hedef hücrelerin içerisine doğrudan yapılan yabancı madde transferidir. Bir mikroenjeksiyon sistemi; hedef hücrenin ve mikropipetin görüntülenmesi, mikropipetin hassas şekilde hareketi ve mikropipet içindeki basıncın ayarlanması olmak üzere üç temel fonksiyonu yerine getirir. Manuel bir mikroenjeksiyon işleminde operatör öncelikle ters mikroskop altında hedef hücre ile mikropipetin ucunu aynı düzleme getirerek manipülatör yardımıyla mikropipetin ucunu yavaşça hücreye doğru yönlendirir. Enjeksiyon pipeti başka bir mikropipetle hareketsiz hale getirilen hedef hücrenin zonası ile temas ettiğinde hızlı bir saplama hareketiyle zona penetrasyonunu sağlar. Zona penetrasyonundan sonra, operatör mikropipetin ucu hücre içine girene kadar manipülatör ile mikropipeti yönlendirir. Mikropipet hücre içine girince pipet içindeki basıncı ayarlayarak transfer edilecek maddeyi hücre içine bırakır ve yavaşça pipeti geri çeker. Tahmin edileceği gibi, mikro seviyede yapılan mikroenjeksiyon işlemi hassas ve kırılgan biyolojik organizmalar ile yapıldığından hedef organizmaya zarar gelmesini engellemek ve başarılı bir enjeksiyon gerçekleştirmek diğer madde transferi işlemlerine göre daha kapsamlı çalışma gerektirir. Enjeksiyon pipetinin hassas konumlandırılmasını sağlamak ve delme işlemi sırasında hareket hassasiyetini korumak başarılı bir enjeksiyon işlemi için hayati öneme sahiptir. Bu nedenle işlem, hassas hareket imkanı sağlayan manipülatörler ile organizmayı delecek mikro deliciler başta olmak üzere özel ekipmanlar gerektirir. Ayrıca, bir mikroenjeksiyon işleminde, operatörün beceri ve deneyimi başarılı bir enjeksiyon elde etmede önemli bir rol oynar. Operatörlerin gereken el beceresini geliştirebilmeleri için genellikle uzun süre eğitim almaları ve uygulama yapmaları gerekir. Bu kapsamda günümüzde delme işlemi için kullanılan cihazların çoğu piezo eyleyici tabanlıdır. Piezo delicilerde piezoelektrik etkiden faydalanılarak üzerine dışarıdan gerilim uygulanan piezoelektrik kristalin mekanik bozulması ile hareket sağlanır. Bu sayede cihazda değişken sayıda, frekansta ve genlikte eksenel darbeler oluşturulur ve mikropipetin ucunun ileriye doğru hareketi sağlanır. Piezo tabanlı eyleyicilerle yapılan ilk başarılı fare embriyosu enjeksiyonunda, araştırmacılar yüksek ataletinden dolayı enjeksiyon pipeti içerisine cıva yerleştirdiler ve bundan sonraki çalışmalarda diğer araştırmacılar da cıvadan yararlandılar. Cıvanın pipet hareketi üzerindeki olumlu etki şekli tartışmalı olmakla beraber genel olarak hedef hücrelerde travmatik etki yaratan cihaz titreşimlerini azaltması ve delme işlemine destek olması ile mikroenjeksiyon işleminin başarı oranını arttırdığı deneysel çalışmalarla gösterilmiştir. Özellikle fare embriyolarında düz uçlu pipetlerle yapılan işlemlerde cıvasız başarı oranı oldukça düşüktür. Son derece esnek olan oosit zarı oolemma pipetin hareketine cevap vermekte ve esneyerek delme işleminin gerçekleşmesine engel olmaktadır. Cıva, enjeksiyon başarısını arttırmak için iyi bir çözüm sunmasına rağmen, oldukça zehirli bir madde olduğundan hem manipülatör operatörü hem de enjeksiyon yapılan organizma için tehlike yaratmaktadır. Dahası cıva kullanımı bazı kurumlarda son derece kısıtlıdır. Ayrıca mevcut mikro deliciler meyve sineği ve Caenorhabditis elegans operasyonlarında etkisiz kalmakta ve operatörler pipet kırılması problemiyle sıkça karşılaşmaktadır. Araştırmacılar, cıvanın toksik etkisi ortadan kaldırmak ve delme başarısını arttırmak için cıva içermeyen yeni piezo tabanlı deliciler geliştirmektedirler. Bu tezde piezo eyleyicilerin yetersizliklerini giderecek kullanımı kolay, cıvasız rotasyonel osilasyonlu bir mikro delici tasarımı, kontrolü, üretimi ve deneysel çalışmaları sunulmuştur. Tasarımın delme mekanizması Ros-Drill© cihazına dayanmakta, cihaz eksenel darbeler yerine rotasyonel osilasyonlar üreterek matkap etkisi ile delme işlemini gerçekleştirmektedir. Mikro delicinin değişken frekanslı ve değişken genlikli rotasyonel osilasyonları ile fare yumurtalarının esnek zarları ve Caenorhabditis elegans kurtçuklarının sert zarları başarıyla delinmiştir. Cihazda, rotasyonel hareketleri üretmek için mili boşluklu bir fırçasız doğru akım motoru kullanılmıştır. Fırçasız motor ile, fırçalı motorların fırça-kolektör yapısından kaynaklanan sürtünme momentinin yarattığı problemler ortadan kaldırılmıştır. Ayrıca fırçasız motorlar düşük eylemsizlikleriyle osilasyon ile delme hareketinin gerektirdiği yüksek hızlı ve hassasiyetli ivmelenme, yavaşlama ve yön değiştirmeyi içeren aralıklı hareket profili için oldukça uygunlardır. Yeni tasarımda mikropipet tutucu, motor milinin merkez ekseni boyunca geçirilmiş ve bir halka aracılığla sabitlenerek kayması engellenmiştir. Bu tasarım ile ekstra bir yataklamaya ihtiyaç kalmamış, sistem boyutu arttırılmamış, kaplin dinamiği etkileri ve yataklama sorunları ortadan kaldırılmıştır. Ayrıca motor için bir bağlantı mekanizması tasarlanarak motorun farklı manipülasyon sistemlerine entegrasyonu ve pipet ucuna istenilen yönün ve oryantasyonun verilebilmesi sağlanmıştır. Delme anındaki istenen hareket profilini elde etmek için fırçasız doğru akım motorunun sinusoidal bir konum referansını takip etmesi; sabit bir nokta etrafında küçük genlikli yüksek frekanslı osilasyonlar yapması gerekmektedir. Ayrıca tasarlanan cihazın farklı organizmalarda farklı manipülasyon işlemlerinde kullanılabilmesi için osilasyon frekans ve genliği geniş bir aralıkta ayrı ayrı ayarlanabilir olmalıdır. Bu özel hareket profili için klasik üç fazlı eviriciye ve elektronik komütasyona ihtiyaç duyulmamaktadır. Motorun, iki fazı arasına uygulanan sinüs formundaki bir gerilim ile genliği kaynak geriliminin genliğiyle orantılı kaynak frekansında osilasyon yapması sağlanmıştır. Motorun osilasyonlarını sabit bir nokta etrafında etrafında yapması için alternatif gerilime ek olarak bir doğru gerilim uygulanmıştır. Motorun iki fazı arasına doğru gerilim uygulandığında, hava aralığında doğru manyetik alan oluşmakta ve motor belirli bir konuma hizalanmaktadır. Ardından motorun diğer iki ucu arasına sinüsoidal bir gerilim kaynağı bağlandığında; motor, hizalandığı konum etrafında sinüsoidal kaynak gerilimi ile aynı frekansta kaymadan osilasyon yapmaktadır. Rotasyonel osilasyonların genliğini istenilen değerde tutmak için ise kapalı çevrim konum kontrolü yapılmış, sinüsoidal gerilimin genliği buna göre ayar edilmiştir. Motorda konum geri beslemesi miline bağlanan 5000 CPR artımlı enkoder ile sağlanmıştır. Enkoder verileri yeni geliştirilen bir yöntem ile işlenerek açısal yer değiştirmenin büyüklüğü yani motor osilasyonlarının genliği elde edilmiş ve konum kontrolünde geri besleme olarak kullanılmıştır. Kontrolör olarak PI tipi bir kontrolör tercih edilmiştir. Ayrıca, integral teriminden kaynaklı aşımları engellemek için sarmasız bir kontrol yapısı da sisteme eklenmiştir. Tasarlanan cihazda kontrolör olarak, analog ve dijital giriş/çıkış birimleri ile enkoder modülüne sahip bir endüstriyel bilgisayar kullanılmıştır. Motoru sabitlemek için kullanılan doğru gerilim, endüstriyel bilgisayarın ilgili çıkışından alınırken, yüksek frekanlı sinüsoidal gerilimler yaratmak için bir gerilim kontrollü osilatör yapısından faydalanılmıştır. Osilatör devresinin parametreleri, sinüsoidal gerilimin frekansını 0-1000 Hz, genliğini ise 0-5.4 Vpp yapacak şekilde seçilmiştir. Motor sürücüsü olarak doğru ve alternatif gerilimler için bir lineer kuvvetlendirici tasarımı yapılmış ve ürettirilmiştir. Cihazdaki parametrelerin ayarlanması için ise bir insan makine arayüzü tasarımı yapılmıştır. Cihazın operatör kontrol paneline motor osilasyonlarının genliğinin ve frekansının seçilebileceği iki adet ayar düğmesi yerleştirilmiştir. Son olarak, manipülasyon sırasında operatör her iki elini de kullandığından delme hareketini aktive etmek için bir ayak pedalı konulmuştur. Yapılan tasarım sonucunda yeni tip rotasyonel osilasyonlu delicide motor seçimi, motor sürücüsü ve geliştirilen kontrol yöntemi ile osilasyonların hassas ve yumuşak olması sağlanmış cıva kullanımının sağladığı hareket kararlılığına olan gereksinim ortadan kaldırılmıştır. Deneysel çalışmalar kapsamında öncelikle önce motorun verilen sinüsoidal konum referansını başarıyla takip ettiği ve yüksek hızlı kamera görüntüleriyle tasarımın pipet ucundaki yanal titreşimleri ciddi oranda azalttığı gösterilmiştir. Cihazın etkinliğini test etmek için fareler ve Caenorhabditis elegans kurtçuklar ile çalışmalar yapılmıştır. Fare oositleri üzerinde zona pellicuda ve oolemma delme operasyonları gerçekleştirilmiştir. Operasyonlarda Ros-Drill© cihazının prensibine uygun olarak açısız sivri uçlu pipetler kullanılmıştır. Ayrıntılı olarak tarif edilen delme protokolü ile bir grup oositin zona pellicuda ve oolemması delinmiş bir gruba ise herhangi bir işlem uygulanmamıştır. Karşılaştırmalı deney sonuçları delicinin oositlerin hayatta kalma oranları üzerinde olumsuz bir etkisi olmadığını ve bu işlemde kullanılabilirliğini göstermiştir. Sonrasında cihaz ile intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu operasyonları yapılmıştır. Enjeksiyon sonrası hücre canlılığı sağlanmış ve gelişim gözlenmiştir. Ek olarak 8 hücreli fare embriyolarında biyopsi operasyonu yapılmış ve operasyon sonrasında embriyolar canlılıklarını korumuşlardır. Caenorhabditis elegans kurtçuklarına yapılan mikroenjeksiyon deneylerinde ise kurtçuk kütikülleri geleneksel yönteme göre çok daha kolay delinmiş enjeksiyon sonrası kurtçuklar canlı kalmışlardır. Tezin son bölümünde motorun açısal yer değiştirmesini ölçmek için sensörsüz yeni bir yöntem önerilmiştir. Yöntem yüksek frekanslar ve düşük genliklerde yetersiz kalan yüksek çözünürlüklü bir enkodere ihtiyaç duymadan açısal yer değiştirmeler için analog bir ölçüm imkanı sunmaktadır. Bu yöntemde motorda kararlı osilasyonlar elde etmek için motora doğru gerilim uygulamak yerine motor hareketlerini sabit bir nokta etrafında tutan mekanik bir sınırlayıcı kullanılmıştır. Boşta kalan motor fazının zıt elektromotor kuvvet değerinden ise yer değiştirme bilgisine ulaşılmıştır. Ayrıca zıt elektromotor kuvvetinin hızlı Fourier dönüşümü ile frekans spektrumu çıkartılarak motorun gelişmiş titreşim analizi yapılmıştır. Önerilen yöntemin başarımı, benzetimler ve deneyler ile doğrulanmıştır. Yöntem ayrıca cihazın olası bir arızası için erken bildirim imkanı da sunmaktadır. Özetle, bu tezde mikroenjeksiyon operasyonları için cıvasız rotasyonel osilasyonlu yeni bir mikrodelici cihaz sunulmuştur. Cihazın tüm tasarım aşamaları ayrıntılı olarak verilmiş, benzetim çalışmaları ve deneysel sonuçlar ile tasarımın başarısı gösterilmiştir. Minimum hasarla gerçekleştirilen başarılı operasyonlar cihazın etkinliğini ortaya koymuştur. tr_TR
dc.contributor.author Nak, Handan
dc.contributor.authorID 636186 tr_TR
dc.contributor.department Kontrol ve Otomasyon Mühendisliği Ana Bilim Dalı tr_TR
dc.date.accessioned 2022-03-22T13:41:12Z
dc.date.available 2022-03-22T13:41:12Z
dc.date.issued 2020
dc.description Tez (Doktora) -- İstanbul Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, 2020 tr_TR
dc.description.abstract Since their invention, microinjection tools have been widely used for cellular micromanipulation operations including intracytoplasmic sperm injection, gene injection, drug development, transgenic animal development and clone creation. Currently, microinjection for mice and some other species is performed with the piezo-driven actuators. In these type of drills, a very small segment of mercury in the proximal end of the pipette is used to increase the success rate. However, the toxicity of mercury causes a serious risk factor both for the operator and the injected organisms. Therefore, there is a demand for mercury-free microinjection devices. This thesis presents a novel mercury-free rotationally oscillating micro drill device based on the same principle of Ros-Drill© for single living organisms. The drilling motion is generated using a hollow shaft brushless direct current motor with an integrated pipette holder in its shaft. The device creates high frequency and small amplitude rotational oscillations at the sharp tip of the injection pipette for piercing. The position of the motor is controlled to track the desired sinusoidal trajectory with a wide range of frequencies and amplitudes to achieve successful piercing with different organisms. A novel control method for the brushless motor is developed and validated with both simulation and experimental studies. Also, high speed camera images show that the design reduces the unwanted lateral vibrations. The biological experimental studies with the new device are conducted on mouse oocytes and Caenorhabditis elegans worms. The experiments reveal that the drill is suitable for piercing mouse zona pellicuda and oolemma considering the minimal damage and acceptable success rates. In microinjection experiments on Caenorhabditis elegans worms, the cuticles of worms are pierced much more easily than the conventional method and all worms survived after injection. The thesis also presents a novel sensorless measurement method for angular displacements of oscillation assisted micro drill device. It requires a mechanical motion limiter for motor and a modification in motor energizing topology. The method utilizes the back-emf voltage and generates analog signals for angular displacements. Simulations and experimental studies reveal that the method is viable for the measurement during cellular piercing operation. It presents fair performance for frequencies up to 1000 Hz. As a conculusion, the novel rotationally oscillating micro drill device presents good performance in terms of successful microinjection operations with different organisms, ease of usage, mercury-free structure, compactness and compatibility with different manipulation systems. tr_TR
dc.description.degree Doktora tr_TR
dc.description.degree Ph. D. en_US
dc.identifier.uri http://hdl.handle.net/11527/20035
dc.language.iso en_US en_US
dc.publisher Fen Bilimleri Enstitüsü tr_TR
dc.subject Biyotıp mühendisliği tr_TR
dc.subject Biomedical engineering en_US
dc.subject Nanoteknoloji tr_TR
dc.subject Nanotechnology en_US
dc.subject Fırçasız elektrik motorları tr_TR
dc.subject Brushless electric motors en_US
dc.subject Doğru akım elektrik motorları tr_TR
dc.subject Direct current electric motors en_US
dc.title A novel rotationally oscillating micro drill for microinjection operations en_US
dc.title.alternative Mikroenjeksiyon operasyonları için yeni bir rotasyonel osilasyonlu mikro delici tr_TR
dc.type Thesis en_US
dcterms.rights Kurumsal arşive yüklenen tüm eserler telif hakkı ile korunmaktadır. Bunlar, bu kaynak üzerinden herhangi bir amaçla görüntülenebilir, ancak yazılı izin alınmadan herhangi bir biçimde yeniden oluşturulması veya dağıtılması yasaklanmıştır. tr_TR
dcterms.rights All works uploaded to the institutional repository are protected by copyright. They may be viewed from this source for any purpose, but reproduction or distribution in any format is prohibited without written permission. en_US
dcterms.type Tez tr_TR
Dosyalar
Orijinal seri
Şimdi gösteriliyor 1 - 1 / 1
thumbnail.default.alt
Ad:
504122107.pdf
Boyut:
13 MB
Format:
Adobe Portable Document Format
Açıklama
Doktora tezi
Lisanslı seri
Şimdi gösteriliyor 1 - 1 / 1
thumbnail.default.placeholder
Ad:
license.txt
Boyut:
3.06 KB
Format:
Item-specific license agreed upon to submission
Açıklama