Molecular genetic assessment of immune modulators in eosinophils and t cells both in silico and in vitro utilizing photoacoustic imaging approaches

Abstract

The immune system is a network of specialized cells and chemicals with distinct functions that have different roles in fighting infection. It protects the host from pathogenic invaders and provides memory of the infection to defend the host against future encounters. The ability of immune cells may extend beyond host defense to include growth, tissue homeostasis, and repair mechanisms. In recent decades, it has been demonstrated that the origin of inflammation determines the immune response and that the immune system plays a role in maintenance, renewal, and sterile inflammation. There are two kinds of responses to non-self: innate responses that can be developed regardless of exposure an adaptive responses that can develop more rapidly with repeated exposures. Anatomical and physiological barriers such as lysozyme in tears, mucosal secretions, gastric pH, and skin constitute the primary defense. When these barriers are compromised, innate immunity is activated to maintain tissue homeostasis and defend against infections, cancer, and toxins. It is rapid, non-specific. The cells of the Innate immunity are eosinophils, basophils, mast cells, monocytes, dendritic cells, neutrophils, and macrophages. They release chemokines and cytokines, remove pathogens by phagocytosis. Eosinophils are multifunctional granulocytes responding to mostly parasitic infections and allergies. They originate in the bone marrow from homeopoietic stem cells in response to IL-5 and GM-CSF. After maturation, they enter bloodstream and tissues via IL-5 and eotaxin signaling. On the other hand, the adaptive immune system includes B and T cells where. T cells mature in the thymus and B cells in the bone marrow, and produce antibodies. Upon maturation, they migrate to secondary lymphoid tissues to capture antigens and initiate responses primed by innate immune signals. T cells are categorized into naive, memory, and regulatory subsets. Upon activation, they produce IL-2 andthey differentiate into effector cells enhancing the clearance via cytokines and cytotoxic mediators. Pattern recognition receptors (PRRs) sense molecular patterns associated with pathogens, apoptotic cells, and senescent cells. They link innate and adaptive immunity by producing non-specific protective mediators. PRRs are grouped by domain homology into TLRs, NLRs, RLRs, and CLRs. They recognize PAMPs and DAMPs, distinguish sterile and non-sterile inflammation. Although associated with innate immunity, PRRs are also expressed by T and B cells, suggesting a functional overlap. NLRP3 is the most studied inflammasome-related PRR, first identified via mutations causing cryopyrin-associated syndromes. It contains NACHT, LRR, and PYD domains, enabling ASC recruitment and caspase-1 activation, leading to pro-IL-1β processing. NLRP3 is unique in being activated by diverse agonists including pathogens, toxins, environmental factors, and DAMPs. The use of advanced imaging techniques to visualize biological processes has become a key focus in this field. Photoacoustic (PA) imaging is a hybrid biomedical imaging technique based on the thermo-acoustic effect generated by laser stimulation. It integrates the benefits of optical and ultrasonic imaging. Consequently, PA imaging is applicable to both pre-clinical research and clinical medicine for the diagnosis of cancer, microcirculation irregularities, and evaluation of therapy efficacy. This thesis presents two-part exploration of innate and adaptive immunity. It begins with a closer look at eosinophil-like cells in the context of PRRs and continues with the functional impact of Montelukast on T cells using both molecular and PA imaging approaches. In the first chapter, the goal was to compare the basal expression of pattern recognition receptors (PRRs)—including both membrane-bound and cytosolic types—in human eosinophil-like cell lines (EoL-1 and HL-60) to human primary eosinophils (HPEs), using publicly available in silico databases. Given the limitations of working with primary eosinophils, determining cell lines that are most closely mimicking primary cells' receptor profiles was a necessary first step toward adopting the most suitable in vitro models. These findings were intended to support future mechanistic studies on eosinophil-driven immunity. The second chapter of this thesis, focuses on the how Montelukast (MNT), a leukotriene receptor antagonist commonly prescribed for asthma, influences inflammatory signaling in Jurkat T cells. To serve this purpose, T cell like Jurkat cells cells were treated with MNT for 48 hours, either alone or in combination with cell activator (C.A). Expression levels of several key immune-related genes and proteins, including CYSLTR1, NLRP3, ASC, IL-1β, IL-10, and signaling molecules such as Akt and ERK, were measured using molecular assays including RT-qPCR, immunoblotting, ELISA, and immunocytochemistry (ICC). In addition to molecular approaches, photoacoustic (PA) imaging was used to examine how MNT treatment affected Jurkat cells changed optical signal characteristics. This combined strategy widened our view on the molecular changes induced by Montelukast in T cells, while also testing the potential of PA imaging as a non-invasive approach for detecting drug-driven immune modulation. In the first chapter, basal expression of PRRs' mRNA levels of human eosinophils were analyzed in silico and comparative profiles of EoL-1 and HL-60 cell lines with HPEs were determined. The analysis showed that levels of TLR2 and NLRP3 mRNA were significantly higher in both cell lines than in HPE (p<0.01), whereas NLRP12, LGP2 and Dectin-1 receptors mRNA levels were higher in HPE than in both cell lines (p<0.01). In addition, TLR6, MDA5, NOD2, NLRP1, CLEC4A were detected to be expressed at higher basal levels in EoL-1 and/or HL-60 than in PE. Although TLR3, TLR8 and TLR9 expressions were not detected in PE, these receptors were expressed in cell lines. TLR5 expression was unique to HPE. MDL-1 (CLEC5A) levels were significantly higher in HL-60 cells as compared to HPE, while CLEC4A expression was higher in EoL-1 cells than in HPE. These data suggested that EoL-1 and HL-60 cells are suitable in vitro models for certain PRRs, however, studying these receptors in cell lines may be challenging, particularly for those such as LGP2, NLRP12 and Dectin-1, which have high expression levels in HPE. In the second chapter, effects of MNT on molecular inflammatory responses in Jurkat T cell line were evaluated at 48 hour post-stimulation. CYSLTR1 mRNA levels were significantly upregulated after 10-⁵ M MNT treatment when compared to control group (~2.5-fold, p < 0.0001). NLRP3 expression was also upregulated by C.A. treatment (p <0.01), and this response was further elevated in the MNT+ C.A. group as compared to control and only-C.A. (p < 0.01). These results showed that MNT may induce inflammation via NLRP3. When ASC adaptor protein was measured by immunoblotting, it was significantly downregulated in both C.A. and MNT+ C.A. groups (p <0.05). We then mesured IL-1β release by ELISA and showed that there was no significant difference between the treatment and control groups (ns). However, , intracellular IL-1β expression was detected to be increased in the C.A. group (p <0.001) and reached the highest level in the MNT+ C.A. group (p <0.01) by immunocytochemical analysis.. We also determine the signal transduction pathways that are potentially involved in the MNT responses. Initially, we investiagted AKT protein, which was decreased in the C.A. group (p <0.05) and no significant difference was observed in p-AKT level. However, the p-AKT/AKT ratio increased in the C.A. group (p <0.01) and this increase was maintained in the MNT+ C.A. group (ns). Phosphorylated ERK ½ (p-ERK1/2) level increased in the C.A. group (p < 0.05) and reached the highest levels in the MNT+ C.A. group (p < 0.01).. In addition we examine the anti-inflamatory response. For this, IL-10 production was analyzed and expectedly, IL10 was not significantly differentially expressed after treatment. As for the photoacoustic imaging results, PA signal amplitude was significantly decreased in the MNT-treated groups- both single treatment and in combination with C.A. when compared to the control and C.A. groups. The mean amplitude value was 2523.22 in the control group, 2283.59 in the C.A. group, 755.66 in the MNT group, and 1088.19 in the MNT+ C.A. group. This suggests that MNT effects on the cells was measured as a reduced photoacoustic signal. In conclusion, the first chapter provided an in silico comparison of PRR expression profiles between eosinophil-like cell lines and HPEs, presenting practical insights into selecting more reliable and suitable models for future in vitro studies on eosinophil-driven immune mechanisms. The second chapter investigated the effects of MNT on inflammatory signaling in Jurkat T cells, revealing changes in cytokine expression, inflammasome-related proteins, and intracellular signaling pathways. The inclusion of photoacoustic imaging enabled the detection of biophysical changes at the cellular level during treatment. By integrating computational, molecular, and imaging-based approaches, this study presents a multi-way exploration of immune responses. Future research may be extented to primary human T cells and other drugs that requires the determination of side effects for different therapeutic interventions.

Bağışıklık sistemi, enfeksiyonlarla kendine özgü şekilde mücadele edebilmek için farklı işlevlere sahip özelleşmiş hücreler ve kimyasallardan oluşan bir ağdır. İnsan vücudunu patojenik istilalardan koruyan ve konağı gelecekteki karşılaşmalara karşı savunmak için enfeksiyonlara ait özgül bir hafıza oluşturan, oldukça gelişmiş ve düzenlenmiş bir sistemdir. Bununla birlikte, bağışıklık hücrelerinin işlev ve kapasiteleri yalnızca konak savunmasıyla sınırlı kalmayıp; büyüme, doku homeostazı ve onarım mekanizmalarını da kapsayabilir. Son yıllarda, enflamasyonun kaynağının herhangi bir antijene karşı immün yanıtın şekillenmesinde belirleyici olduğu ve bağışıklık sisteminin yalnızca enfeksiyöz koşullarda değil, steril doku hasarlarında da önemli bir rol üstlendiği gösterilmiştir. İstilacı mikroorganizmalara karşı esasen iki tür bağışıklık yanıtı bulunmaktadır. Doğuştan gelen bağışıklık, enfeksiyon etkenine maruz kalma sıklığından bağımsız olarak tutarlı bir şekilde ortaya çıkarken, adaptif bağışıklık tepkileri belirli patojenlerle tekrar eden karşılaşmalarla gelişir. Gelişmiş immün yanıtlar öncesinde, anatomik ve fizyolojik bariyerler enfeksiyonlara karşı temel birincil savunmayı oluşturur. Bu bariyerler; gözyaşındaki bakteriyolitik lizozim, mukozal salgılar, gastrik asit ve deri gibi yapılar aracılığıyla sağlanır. Fiziksel bariyerlerin aşılması durumunda, konak savunmasının bir sonraki basamağı olan doğuştan gelen bağışıklık sistemi aktive olur. Doğuştan gelen bağışıklık süreçleri, hücresel bütünlüğün, organizmal denge durumunun ve tüm canlı türlerinin hayatta kalmasının sürdürülmesi için kritik öneme sahiptir. Ayrıca, adaptif bağışıklık aktivasyonundan önce, enfeksiyonlar, kanser hücreleri ve toksik maddelere karşı birincil savunma mekanizmasını oluşturur. Bu sistem genel olarak hızlı, non-spesifik, adaptif olmayan ve immün hafızadan yoksun yanıtlarla karakterizedir. Bu yanıtı gerçekleştiren hücreler arasında eozinofiller, bazofiller, mast hücreleri, monositler, dendritik hücreler, nötrofiller ve makrofajlar yer alır. Bu hücreler, çeşitli kemokin ve sitokinler salgılayarak bağışıklık yanıtını düzenler ve ardından fagositoz yoluyla patojenleri ortadan kaldırırlar. Doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinden biri olan eozinofiller, çok işlevli granülositik lökositlerdir ve viral, bakteriyel, paraziter enfeksiyonların yanı sıra alerjik reaksiyonlara karşı da yanıt oluşturabilirler. İnterlökin-5 (IL-5) ve granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) gibi spesifik sitokinlerin etkisiyle kemik iliğindeki pluripotent progenitörlerden türevlenirler. Olgunlaştıktan sonra, IL-5 ile eotaksin ailesi kemokinleri arasındaki sinerjik sinyalleşme sayesinde periferik dolaşıma geçerek dokulara göç ederler. Adaptif bağışıklık sistemi, timusta olgunlaşan T lenfositleri ile kemik iliğinden köken alan ve farklılaştıktan sonra antikor üretebilen B lenfositlerinin çeşitli alt popülasyonlarından oluşur. Bu hücreler primer lenfoid organlarda olgunlaştıktan sonra, antijenleri tanıma görevini üstlendikleri sekonder lenfoid organlara göç ederler. Adaptif bağışıklık yanıtları bu bölgelerde başlar ve sıklıkla doğuştan gelen sistemden gelen sinyallerle yönlendirilir. Bu sinyaller, dolaşımdaki patojenlerden doğrudan ya da ikincil lenfoid organlara göç eden antijen sunan hücreler (APC'ler) aracılığıyla dolaylı biçimde iletilebilir. T lenfositleri, bağışıklık yanıtının düzenlenmesinde kilit rol oynar ve naif T hücreleri, hafıza T hücreleri ve düzenleyici T hücrelerini içeren periferik alt popülasyonlara ayrılır. Bu hücreler, antijenler ve kostimülatör sinyallerle karşılaştıklarında IL-2 üretir, çoğalır ve efektör hücrelere farklılaşırlar. Ardından sitokin ve sitotoksik aracıların salınımıyla patojen temizliğine katkı sağlarlar. T hücresi toleransının bozulması, alerjen spesifik Th hücrelerinin IL-2 üretimi ile karakterize alerjik tablolarla sonuçlanabilir. Kalıp tanıma reseptörleri (PRR'ler), patojenlerin, apoptotik konak hücrelerin ve yaşlanmış hasarlı hücrelerin yüzeylerinde bulunan özgül moleküler yapıları tanıyabilir. PRR'ler, dendritik hücrelerin ardından, doğuştan gelen bağışıklık ile adaptif bağışıklık arasında moleküler bağlantıyı oluşturan önemli yapılardır. Antienfeksiyöz, antitümöral ve diğer immün koruyucu mediatörlerin üretimini başlatabilirler. PRR'ler çoğunlukla protein alanı homolojilerine göre şu alt gruplara ayrılır: 1) Toll-benzeri reseptörler (TLR'ler), 2) NOD-benzeri reseptörler (NLR'ler), 3) Retinoik asitle indüklenebilir gen-I benzeri reseptörler (RLR'ler), 4) C-tipi lektin reseptörleri (CLR'ler). Bu reseptörler, patojen ilişkili moleküler kalıplar (PAMP'ler) ve hasar ilişkili moleküler kalıplar (DAMP'ler) gibi özgül örüntüleri tanır ve bu sayede hem steril hem de steril olmayan inflamasyonu algılar. PRR'lerin doğuştan gelen bağışıklıkla ilişkili olduğu bilinmesine rağmen, daha sonra T ve B hücrelerinin de PRR ekspresyonu yapabildiği ortaya konmuş ve bu durum doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık arasında işlevsel bir örtüşmenin varlığını göstermiştir. NLRP3, bilinen inflamozom kompleksleri arasında en kapsamlı şekilde çalışılmış PRR'dir. Buna rağmen, işleyişine dair bazı önemli mekanizmalar hâlâ netlik kazanmamıştır. NLRP3 ilk olarak, otoinflamatuar nitelikteki kriyopirin ilişkili periyodik sendromlarla ilişkili bir gen mutasyonunun yol açtığı fonksiyon kazanımı sonucu tanımlanmıştır. NLRP3, merkezi NACHT alanı, C-terminal LRR ve N-terminal PYD alanlarına sahiptir. Bu yapılar, adaptör protein ASC'nin PYD-PYD etkileşimi aracılığıyla komplekse katılımını ve böylece prokaspaz-1'in aktive olarak pro-IL-1β'yı olgunlaştırmasını sağlar. Diğer inflamozomların aksine, NLRP3 inflamozomu patojenler, toksinler, çevresel faktörler ve endojen DAMP'ler gibi yapısal olarak oldukça farklı uyarıcılar tarafından aktive edilebilir. Moleküler düzeydeki bu biyolojik süreçlerin görselleştirilmesi amacıyla yenilikçi görüntüleme tekniklerinin kullanımı da son yıllarda araştırma alanında önem kazanmıştır. Bu bağlamda, fotoakustik (PA) görüntüleme, lazerle indüklenen termo-akustik etkiye dayalı, optik ve ultrasonik görüntüleme avantajlarını bir araya getiren hibrit bir biyomedikal görüntüleme yöntemidir. Klinik öncesi çalışmalardan klinik tıbbi uygulamalara kadar kanser, mikrosirkülasyon bozuklukları ve tedavi yanıtlarının değerlendirilmesinde kullanılmaktadır. Bu tez çalışması, doğuştan gelen bağışıklık yanıtından başlayarak Montelukast'ın T hücrelerinde oluşturduğu etkilerle sonlanan iki ana bölümlü bir araştırma sürecini kapsamaktadır. İlk bölümde amaç, kamuya açık in silico veri tabanları aracılığıyla insan eozinofil benzeri hücre hatları (EoL-1 ve HL-60) ile birincil eozinofillerde hem membran bağlı hem de sitozolik örüntü tanıma reseptörlerinin bazal ekspresyonlarını karşılaştırmaktır. Primer eozinofillerle çalışmanın teknik sınırlamaları nedeniyle, bu analiz hücre hattı seçiminde referans oluşturmayı amaçlamıştır. İkinci bölümde ise, yaygın olarak astım tedavisinde kullanılan lökotrien reseptör antagonisti Montelukast'ın, Jurkat T hücrelerinde inflamatuvar sinyalizasyon üzerindeki etkileri araştırılmıştır. Hücreler, Montelukast'a tek başına ya da hücre aktivatörü (C.A.) ile birlikte 48 saat maruz bırakılmıştır. CYSLTR1, NLRP3, ASC, IL-1β, IL-10, Akt ve ERK gibi gen ve proteinlerin ekspresyon seviyeleri RT-qPCR, Western blot, ELISA ve immünositokimya ile analiz edilmiştir. Hücresel düzeydeki değişimlerin optik sinyal karakteristiklerini değerlendirmek amacıyla PA görüntüleme de kullanılmıştır. İlk bölümde, eozinofil PRR'lerinin mRNA seviyeleri in silico olarak analiz edilmiş ve EoL-1 ile HL-60 hücre hatlarının insan primer eozinofilleri (HPE) ile karşılaştırmalı profilleri sunulmuştur. TLR2 ve NLRP3'ün her iki hücre hattında HPE'ye göre anlamlı düzeyde yüksek olduğu (p<0.01), NLRP12, LGP2 ve Dectin-1'in ise PE'de daha yüksek olduğu belirlenmiştir (p<0.01). TLR6, MDA5, NOD2, NLRP1 ve CLEC4A gibi bazı PRR'lerin bazal düzeyde hücre hatlarında HPE'ye kıyasla daha yüksek ekspresyon gösterdiği gözlenmiştir. İkinci bölümde, 10⁻⁵ M MNT uygulaması sonrası CYSLTR1 mRNA seviyesi kontrol grubuna kıyasla yaklaşık 2,5 kat artmıştır (p<0.0001). NLRP3 ekspresyonu C.A. ile artmış (p<0.01) ve C.A.+MNT grubunda en yüksek seviyeye ulaşmıştır. ASC seviyesi bu gruplarda azalmıştır (p<0.05). IL-1β salınımı ELISA ile anlamlı fark göstermese de, hücre içi ekspresyon C.A. grubunda artmış (p<0.001) ve C.A.+MNT grubunda en yüksek düzeye ulaşmıştır (p<0.01). p-AKT/AKT oranı C.A. grubunda artmış (p<0.01), p-ERK1/2 ise MNT+C.A. grubunda en yüksek seviyeye çıkmıştır (p<0.01). PA görüntüleme sonuçlarında, MNT uygulanan gruplarda PA sinyal genliği anlamlı şekilde azalmıştır; ortalama amplitüd kontrol grubunda 2523,22 iken MNT+C.A grubunda 1088,19'dur. Sonuç olarak, bu tez çalışmasının ilk bölümünde, in silico analizlerle PRR profilleri karşılaştırılarak eozinofil temelli bağışıklık araştırmaları için en uygun in vitro modeller belirlenmiştir. İkinci bölümde, Montelukast'ın aktive edilmiş Jurkat T hücrelerinde inflamatuvar sinyalizasyonu nasıl etkilediği moleküler ve görüntüleme düzeyinde ortaya konmuştur. PA görüntülemenin bu süreçteki kullanımı, bağışıklık modülasyonunu noninvazif biçimde izleme potansiyelini göstermiştir. Çalışma; hesaplamalı, moleküler ve görüntüleme tabanlı yaklaşımların bütünleştirilmesiyle bağışıklık araştırmaları için çok boyutlu bir platform sunmaktadır. Gelecekteki çalışmalar, hastalık modelleri altında PRR ilişkili mekanizmaları doğrulamak ve immün hücre yanıtlarını dinamik biçimde görüntülemek için bu stratejiyi daha da ileriye taşıyabilir.