Development of microfluidic based single cell capturing systems for early detection of diseases

Abstract

It is known that cancer cells in the bloodstream are quite low compared to other cells in the blood. Microfluidic based systems have been studied for diagnosis, follow-up of the disease and new drug tests to be performed on this disease. A microfluidic based system with two successive regions for separation and analysis has been developed. In the first region, the target cell type is differentiated from a complex mixture containing multiple cells by dielectrophoresis, which allows an insulating particle to be polarized under an electric field. Since different cell types can be polarized at different rates under the same electric field, this method allows the separation of the cells from each other under suitable conditions. In this study, a microfluidic system consists of two consecutive regions, namely the separation and analysis regions are demonstrated. In the first region, the target cell type is separated by dielectrophoresis from a complex cell mixture. The target cells collected in the first region are continuously transferred to the second region and are captured in a single cell array formation at the hydrodynamic capture stations placed on the measuring electrodes. Impedance analysis was performed to establish a platform for detection and drug screening. While both regions were integrated on a single chip in the final device, each region were examined separately during our study. The results of impedance analysis obtained from different cells based on different medium conductivities with a frequency range of 0.1kHz – 500kHz are presented here. We recorded impedance measurements at stations where cells were individually captured before and after cell entrapment. Experimental results are divided into cases where the conductivity of the medium is higher and lower than the cell conductance. Overall magnitude of impedance shift is significantly higher when the medium conductivity is lower than the cell conductance. When all results are evaluated, it can be seen that depending on the target cell type, an optimum medium conductivity and frequency range can be selected so as to obtain the measurement result with the highest sensitivity. A microfluidic cell culture platform, named as organ-on-a-chip in the literature, has been increasingly studied over the last few years to mimic tissue and organ-level physiology, containing a membrane with a continuous and porous structure inhabited by living cells, and with microfluidic channels to mimic the mechanical effects and to supply the necessary nutrients. These platforms create tissue and organ environments that are not possible with traditional 2D or 3D culture systems, and enable real time imaging and analysis of biochemical, genetic and metabolic activities of living cells. In this project, present fabrication techniques of microfluidic devices are used for the fabrication of organ-on-a-chip platforms. The tissue structure was imitated by coating a single-layer cell on the upper and lower sides of the membrane in the structures of the renal chip tubules and lung alveoli on organ-on-a-chip platforms. The cell viability was characterized by MTT test and the cell viability was maintained by providing oxygen, carbon dioxide and nutrient exchange under incubation conditions by means of nutrient medium flow provided into the upper and lower channels, and the barrier property of the cell tissue was measured by electrical resistance (TEER) measurements. The viability of the renal tubules cultured in the microfluidic system between 0-48 hours was recorded by MTT assay. TEER results showed that the tight-junctions of cell tissue were different under static and dynamic conditions in the kidney-on-chip systems. The results obtained by MTT test to measure cell viability were in agreement with TEER and the viability of kidney cells was higher in 48 hours under dynamic conditions compared to static conditions. With the successful culturing of two different cell types under static conditions in lung-on-chip systems, their viability and cell barrier resistance values were recorded by TEER measurement for 0-48 hours. The results obtained by MTT test and TEER measurements showed that lung cells under shear stress and mechanical stress had higher viability than cells under static conditions.

Kan dolaşımındaki kanser hücrelerinin, kandaki diğer hücrelere göre oldukça düşük sayıda olduğu bilinmektedir. Hastalığın tanılanması, takibi ve bu hastalık üzerinde gerçekleştirilecek yeni ilaç testlerine yönelik mikroakışkan tabanlı sistemler üzerinde çalışılmıştır. Ayrıştırma ve analize yönelik birbirini takip eden iki bölgenin yer aldığı mikroakışkan tabanlı bir sistem geliştirilmiştir. İlk bölgede, hedef hücre tipi, birden fazla hücre tipini barındıran karmaşık bir topluluktan dielektrofrez ile ayrıştırılmaktadır. Dielektrofrez, yalıtkan bir parçacığın elektriksel alan altında kutuplanarak yönlendirilmesine imkân vermektedir. Farklı hücre tipleri aynı şartlar altında farklı oranlarda kutuplanabildiğinden, uygun şartlarda hücrelerin birbirlerinden ayrılması bu yöntemle sağlanabilmektedir. Bu çalışmada, birinci bölgede (ayrıştırma bölgesi) dielektrofrez ile ayrılan hedef hücreler kesintisiz olarak ikinci bölgeye (analiz bölgesi) iletilerek burada hidrodinamik yakalama istasyonlarında tekil olarak yakalanmakta ve her bir hücre ölçüm elektrotlarının üzerine yerleşmektedir. Analiz bölgesinde, hedef hücrenin tanılanmasına ve ilaç testlerine yönelik olarak bu elektrotlar üzerinden empedans analizi gerçekleştirilmektedir. Araştırmamızda her iki bölge de ayrı olarak ele alınmış, en iyi sonucu veren tasarımlar son üründe bir araya getirilmiştir. Farklı medyum iletkenlikleri ve farklı tipte hücreler ile yapılan deneysel çalışmalar bu tezde sunulmuştur. Analiz bölgesinde, istasyonlarda yer alan elektrotlar üzerinden, hücre yakalanmadan önce ve sonra empedans verileri kaydedilmiştir. Deneysel çalışmalarımız medyum iletkenliğinin hücre iletkenliğinden daha yüksek ya da düşük olduğu durumlar olarak iki gruba ayrılmaktadır. Medyum iletkenliği hücre iletkenliğinden düşük olduğunda empedans kaymasındaki toplam değişim oldukça yüksek olduğu görülmüştür. Tüm sonuçlar değerlendirildiğinde, hedef hücre tipine bağlı olarak, en yüksek hassasiyette tanılamaya yönelik olarak optimum bir medyum iletkenliği ve frekans aralığının belirlenebileceği görülmektedir. HCT116 hücreleri için empedans sapması çözelti iletkenliği azaldıkça azalırken, MDA-MB-231 hücreleri için empedans sapması çözelti iletkenliği ile arttığı kaydedilmiştir. HEK293 hücreleri ise incelenen iki çözelti iletkenlik seviyesinde benzer empedans sapmaları göstermiştir. Hücre tipleri birbirleriyle karşılaştırıldığında HCT116 ve HEK293 hücre hatları, 1XPBS solüsyonunda benzer empedans sapmaları üretirken, 0.1XPBS konsantrasyona sahip solüsyonlarda aralarındaki empedans sapmalarında belirgin bir fark meydana gelmiştir. Ortam iletkenliği hücre iletiminden daha düşük olduğunda, hücreden daha fazla akım geçer ve empedans kayması negatiftir. Böylelikle hücre tipi hakkında daha fazla bilgi toplanır ve tanısal duyarlılık artar. 200 mM sükroz çözeltisinde kanserli lenfosit hücreleri ile sağlıklı kan hücreleri arasında belirgin bir empedans sapması farkı vardır. Üretilen sistemin sağlıklı kan hücrelerini ayırt etmede en yüksek hassasiyete sahip olduğu aralık 200mM sükroz çözeltisi için 0.1kHz ve 10kHz frekans aralığıdır. Belirli bir frekansta kaydedilen empedans kayması hedef hücre tipi ve evresine yönelik tanılama olanağı sunmaktadır. Kanser hücrelerinin tanılanması ilaç testlerinde, ilacın çalışma mekanizması ve hücre biyolojinin anlaşılmasında oldukça kritiktir. Farklı kimyasal ve ilaç konsantrasyonlarının hücre üzerindeki etkisinin bu proje ile geliştirilen sistem ile takip edilmesi, tanılanması ve iyileştirilmesi mümkün kılınmaktadır. Dielektrofrez ile ayrıştırma bölgesi için numerik analizler ile ayrıştırma parametreleri araştırılmıştır. Üretilecek mikrokanal ve mikroelektrot geometrileri bu analizler sonucunda belirlenmiştir. Deneysel çalışmalar farklı çaptaki polistren parçacıklar ile başlayıp, çeşitli biyolojik hücreler için de ayrıştırma koşulları belirlenmiş ve bu koşullar göz önünde tutularak sürekli akışın olduğu sistemlerde ayrıştırma gerçekleştirilmiştir. Polistren parçacıklar için %100 verimle ayrıştırma gerçekleştirilirken Jurkat, Daudi, HL-60 ve THP-1 hücreleri ile yapılan çalışmalarda da frekansa bağlı ayrıştırma bölgeleri incelenmiş, Jurkat ve Daudi ile yapılan deneylerde ayrıştırma sağlanmış ve Daudi hücresinde 23 kat zenginleştirme gerçekleştirilmiştir. Dielektroforez ile ayırma ve empedans analizli sistemler de üretilmiş olup, K562 hücrelerinin bu sistemle yönlendirildiği ve istasyonlarda toplandığı deneysel çalışmalarda kayıt altına alınmıştır. Nihai sistemin ayrıştırma verimliliğini ölçmek için, sisteme entegre edilen her hücre tipi farklı bir renkli floresan boya ile etiketlenmeli ve floresan mikroskop altında izlenmelidir. Ayrıca dielektroforez ile ayırma sonrası çıkışlardan toplanan hücreler akış sitometrisi ile sayılmalı ve ayırma etkinliği gösterilmelidir. Bu tezde mikro üretim teknolojileri kullanılarak çip-üstü organ sistemleri geliştirilmesi hedeflenerek sürekli akış içeren dinamik koşullar ve akış olmayan statik koşullar altında hücre farklılaşmasına yönelik sonuçlar da toplanmıştır. Böbrek proksimal tübül hücreleri kullanılarak çip-üstü böbrek sistemleri üretilmiş, mikroakışkan sistem içinde ve akış altında kültüre edilmiş, canlılıkları ve hücre dokusunun bariyer özelliği elektriksel direnç değerleri ile takip edilmiştir. Çip-üstü akciğer sistemlerinde insan alveol hücreleri kullanılarak statik koşullar altında iki farklı tipte hücre aynı mikroakışkan sistemde kültüre alınmış ve canlılıkları, hücre dokusuna ait bariyer özelliği aynı yöntemler ile takip edilmiştir. Literatürde çip üstü organ (organ-on-a-chip) olarak adlandıran, doku ve organ seviyesi fizyolojisini simüle etmek için düzenlenmiş, farklı hücrelerin canlılığını koruduğu, hücrelerin tek katmanlı olarak yüzeyinde barındığı sürekli ve boşluklu yapıya sahip membran içeren, mikrokanallarda ortam için gerekli sıvı akışının ve mekanik etkilerin oluşturulduğu bir mikroakışkan hücre kültürü platformu geliştirilmesi son birkaç yıldır araştırmaların giderek arttığı güncel bir konu haline gelmiştir. Çok hücreli mimarileriyle doku-doku arayüzlerini, fizyokimyasal mikro ortamları ve doku hücreleriyle temas eden kılcal damar geçirgenliğini simüle eden bu platformlar, geleneksel 2D veya 3D kültür sistemleri ile mümkün olmayan doku ve organ ortamı oluşturarak, canlı hücrelerin biyokimyasal, genetik ve metabolik aktivitelerinin, fonksiyonel doku ve organ bağlamında gerçek zamanlı görüntülemesine ve analizine olanak sağlarlar. Bu çalışmada, mikroakışkan sistemleri üretiminde yaygın olarak kullanılan mikro üretim aşamaları kullanılmıştır. Geliştirilecek çip üstü organ platformunda, böbrek tübülleri ve akciğer alveolleri yapılarında membranın alt ve üst tarafında tek katmanlı hücre kaplanmasıyla doku yapısı taklit edilmiştir. Alt ve üst kanal içerisine sağlanan besiyer akışı ile inkübasyon koşullarında oksijen, karbondioksit ve besin alışverişi sağlanarak hücresel canlılığının korunup korunmadığı MTT testi ile ve hücre dokusunun bariyer özelliği elektriksel direnç (TEER) ölçümleriyle karakterize edilmiştir. Mikrokanalın alt ve üst yüzeylerinde metal elektrotlar bulunan ve ortasında membran bulunan mikroakışkan sistemler, çip üstü organ platformları için başarıyla üretilmiştir. Özellikle çip üzerinde böbrek uygulamasında tatmin edici sonuçlar kaydedilmiş ve dinamik koşullarda mikroakışkan sistemdeki hücre kültürlerinin sıkı bağ dokularındaki artış elektriksel ölçümlerle kaydedilmiştir. Çip üstü böbrekte dinamik koşullarda başlangıçta bir miktar hücre canlılığı kaybı olmasına rağmen, hücre canlılığının hızla düzeldiği ve arttığı görülmektedir. Hücre konsantrasyonları aynı olmasına rağmen dinamik koşullarda hücrelerden elde edilen direnç değerleri statik koşullara göre 7 kat daha yüksektir. Bu durum, hücre farklılaşmasının gerçekleştiğini ve sıkı bağ dokularının oluştuğunu göstermektedir. 0-48 saat aralığında çip-üstü böbrek sistemlerinde statik ve dinamik koşullar altında kültüre edilen böbrek tübüllerinin canlılıkları MTT testi ile kaydedilmiş, sıkı bağ oluşturma oranlarının farklı olduğu TEER sonuçları ile kaydedilmiştir. Hücre canlılıkları ölçemeye yönelik MTT testi ile elde edilen sonuçlar TEER ile uyum içinde olup, dinamik koşullar altında 48 saat içerisinde böbrek hücrelerinin canlılıklarının statik koşullara kıyasla daha yüksek olduğu görülmüştür. Çip-üstü akciğer sistemlerinde, iki farklı hücre tipi birlikte başarılı bir şekilde kültürlenmiştir. Canlılık ve hücre bariyer direnci değerleri statik ve dinamik koşullar altında kaydedilmiştir. MTT testi sonuçları incelendiğinde, statik koşullarda hücre canlılığı dinamik koşullara göre ilk 24 saat daha düşük kalmış ancak hücre canlılığı, böbrek uygulamasında görüldüğü gibi 48 saat sonunda statik ve dinamik koşullar için yakın değerler göstermiştir. Çip-üstü akciğer sistemi üzerinde, statik ve dinamik koşullar için alınan TEER değerleri, hücre bariyerinden okunan direnç değerinin dinamik koşullardan daha yüksek olduğunu ve hücre aralarında sıkı bağ dokuların oluştuğunu göstermektedir ve hücre farklılaşmasının gerçekleştiğini göstermektedir. Üretilen çip-üstü akciğer sistemlerinde statik koşullar altında iki farklı hücre tipinin bir arada başarı ile kültüre edilmesi ile 0-48 saat aralığında canlılıkları ve hücre bariyeri direnç değerleri TEER ölçümü ile kaydedilmiştir. MTT testi ve TEER ölçümleri ile alınan sonuçlarda kayma gerilmesi ve mekanik gerilme altındaki akciğer hücrelerinin, statik koşullardaki hücrelere göre daha yüksek canlılığa sahip olduğu görülmüştür. Proje çıktısı olarak ürettiğimiz üç boyutlu mikroakışkan doku/organ çip üstü kültür sistemi prototip ürün olarak geliştirilmiş olup doku geliştirme, organ fizyolojisi, ilaç tarama ve geliştirme araştırması, moleküler taşıma mekanizmaları, toksisite testi ve biyobelirteç tanımlama gibi farklı alanlarda kullanılabilecek bir teknoloji platformudur. Özellikle ilaç geliştirme, nihai ilacın pazara sunulma sürecini kısaltarak ve kişiye özel ilaç geliştirme alanında araştırmacıların ve bilgi birikiminin gelişmesine önemli katkı sağlayacak ürünler için yeni projeler ve iş birlikleri yaratacaktır.