Fonksiyonel Çikolata Geliştirilmesi: Bitter Çikolatanın Nano-lipozomla Enkapsüle Edilen Antioksidanlarla, Ve/veya Pro- Ve Pre-biyotiklerle Zenginleştirilmesi, Biyoyararlılık Çalışmaları

Abstract

Kakao tanesi ile kakao, ve çikolata gibi türevleri oldukça güçlü antioksidan aktivite gösteren prosiyanidinler açısından son derece zengin bir kaynaktır. Tezin ilk bölümünde, kakao prosiyanidinlerinin stabilitesi, antioksidan aktivitesi ve biyoyararlılığı çalışılmıştır. Çalışmada kavrulmamış (fermente edilmiş ve kurutulmuş) ve kavrulmuş kakao çekirdekleri, bunlardan elde edilen doğal ve alkali kakao likörü ile kakao tozu örnekleri toplam fenolik madde (TPC) ile toplam flavonoid (TFC) içerikleri ve antioksidan aktiviteleri (hem DPPH hem de ORAC metotları) açısından değerlendirilmiştir. Böylece kakao üretimi sırasındaki fenolik değişimi gözlenmiştir. TPC ve TFC açısından NCL > UCB > RCB ≈ ACL ≈ CP sırası takip eişlmektedir (p < 0.05). TPC ve TFC arasında yüksek bir korelasyon söz konusudur (R2= 0.97). Antioksidan aktivite fenolik madde içeriğine göre değişmektedir. DPPH yöntemine göre NCL ≈ UCB > RCB > ACL ≈ CP sırası söz konusu iken ORAC yöntemine göre ise NCL > UCB ≈ RCB ≈ ACL ≈ CP sırası izlenmektedir (p < 0.05). TPC ve ORAC sonuçları arasındaki korelasyon (R2= 0.97) olup TPC ve DPPH sonuçları arasındaki korelasyondan (R2= 0.70) daha yüksektir. Sözü geçen kakao kaynaklarından en fazla fenolik madde içeren ve dolayısıyla güçlü antioksidan aktivite gösteren “doğal kakao likörü” en iyi fenolik kaynağı olarak belirlenmiştir. Kakao çekirdeklerinin kavrulup öğütülmesiyle elde edilen kakao likörü bu esnada hücre duvarının yıkılması ve fenoliklerin dışarı sızması sonucu en yüksek fenolik içeriğine sahiptir. Ancak, kavurma ve alkalizasyon uygulamaları fenolik madde içeriğinde önemli ölçüde kayba sebep olmaktadır. Örneklerin fenolik profilleri düşünüldüğünde ise EC ve C monomerleri, EGC, B2 dimeri ve C1 trimerinde kavurma ve alkalizasyon sırasında azalma görülmüştür. Ancak son üründe C konsantrasyonunun arttığı gözlenmiştir. Bu sırada EC’nin C’e izomerizasyonu, (+)-kateşinin (-)-kateşine epimerizasyonu veya prosiyanidin oligomerlerinin monomerlerine dönüşümü söz konusudur. Tezin ikinci bölümünde, endüstriyel çikolata üretimi sırasındaki prosiyanidin profili ve antioksidan aktivitedeki değişim incelenip optimal üretim koşulları belirlenmeye çalışılmıştır. Deneme deseni Tepki-Yüzey yöntemi kullanılarak oluşturulmuştur. Konçlama sıcaklığı (60–80°C), kakao tanelerinin kavurma sıcaklığı (115–155°C) ve alkalizasyon derecesi (7-9 pH) faktör olarak seçilmiştir. Toplam fenolik madde ve flavonoid içeriği, antioksidan aktivite, (EC50 ve H-ORAC+L-ORAC), ile epikateşin, kateşin, Dimer B2 ve Trimer C1 içerikleri sonuçları cevap olarak seçilmiştir. Deneysel veriler kullanılarak sonuçları tahmin etmede kullanılacak olan eşitlikler oluşturulmuştur. ANOVA sonuçlarına göre p > 0.05 olduğu için (0.844, 0.538, 0.772, 0.435, 0.751, 0.828, 0.095, 0.634) ve R2 (0.955, 0.971, 0.776, 0.838, 0.5034, 0.907, 0.937, ve 0.663) değerlerine göre TPC, TFC, EC50, TAC (H-ORAC+L-ORAC), C, EC, Dimer B2 ve Trimer C1 açısından model uygun bulunmuştur. Modelde p değeri 0.05’den küçük olan terimler önemli görülmüştür. Modelden elde edilen eşitliklerdeki önemli terimler dikkate alındığında, RT ve pH’nın lineer terimleri TPC, TFC, C, EC, Dimer B2 and Trimer C1 değerlerini negatif etkilemekte iken EC50 değerini pozitif yönte etkilemektedir. RT and pH etkileşiminin TFC ve Dimer B2 üzerine olumlu etkisi söz konusu iken RT ve CT etkileşiminin TAC ve EC üzerine olumsuz etkisi söz konusudur. Ayrıca, pH ve CT etkileşimi Dimer B2’yi olumsuz olarak etkilemektedir. Diğer taraftan, RT’nin kuadratik terimi TFC’yi pozitif yönde etkilerken TAC değerini negatif yönde etkilemektedir. CT ve pH’nın kuadratik terimleri EC ve Dimer B2’yi olumlu etkilemektedir. Optimum proses koşullarını belirlemek için, modelin ürettiği optimum koşullarda deney tekrarlanmıştır. Deneysel verilerle programın tahminlediği sonuçlar birbirine oldukça yakın çıkıp modelin validasyonunu sağlamıştır. Tezin üçüncü bölümünde, probiyotik bir bakteri olan Bacillus indicus HU36 ve diyet lifleri ilavesinin bitter çikolatanın renk ve organoleptik kalitesi, ve canlı probiyotik bakteri sayısı üzerine üzerine etkilerinin incelenmiş ve formülasyon koşulları Yanıt Yüzey Yöntemi kullanılarak optimize edilmiştir. B. indicus HU36, COLORSPORE (Proje no: 207948) akronimli AB 7th Çerçeve projesi kapsamında temin edilmiştir. Bitter çikolata kalıpları (50 g kakao/100 g) Nestle Türkiye Gıda A.Ş. tarafından hediye edilmiştir. Kalıplar 45°C’de su banyosunda eritildikten sonra liyofilize B. indicus HU36 sporları 6.08 log kob/g çikolata olacak şekilde eklenmiştir. Yerel firmalardan temin edilen diyet lifleri (maks. partikül boyutu 40 mikron) de ilave edildikten sonra karışım tabliering metodu ile temperlenmiştir. Oda sıcaklığına soğutulduktan sonra, örnekler 18°C’de depolanmıştır. 3 seviyeli [1.5, 3.5, 5.5 (g/100g)], 2 faktörlü (maltodekstrin, limon lifi) merkezi tümleşik tasarım uygulanarak simbiyotik çikolatalar üretilmiştir. Tanımlayıcı duyusal analiz (QDA®) ve renk analizi faktörlerin ve seviyelerinin tanımlanan kalite özellikleri üzerine etkisini açıklamada kullanılmıştır. B. indicus HU36’nın örneklerdeki canlılık oranı 88-91% arasında değişmiştir. Bakteri ve lif ilavesi, çikolatanın duyusal özelliklerini olumsuz olarak etkilemezken, diyet lifi ilavesi tatlılık, sertlik ve yapışkanlık gibi duyusal özelliklerin artmasına sebep olmuştur. Design Expert 8.0.4 kullanılarak optimum formülasyon değerleri belirlenmiş ve üretilen çikolataların duyusal skorları ile modelin tahminlediği skorlar birbirlerine oldukça yakın çıkmışlardır (sırasıyla tatlılık, sertlik ve yapışkanlık için R2 0.95, 0.93 ve 0.99). Bu çalışma sonucunda hazırlanan tüm çikolata örnekleri 5 log cfu/g ‘dan daha fazla B. indicus HU36 içerdiği için probiyotik ürün olarak tanımlanmışlardır. Optimizasyon sonuçları, limon lifinin 1.5 g/100 g’da sabit tutulduğu ve maltodekstrin konsantrasyonunun 3.2-3.9 g/100 g arasında değiştiği formülasyonlar ile duyusal açıdan en çok beğenilen çikolata örnekleri elde edileceğini göstermiştir. Tezin son bölümünde, kara dut antosiyaninleri ekstraktı kitosanla kaplanan lipozoma enkapsüle edilerek çikolataya eklenmiştir. Soya ya da yumurta lesitini kullanılarak üretilen lipozomlar son yıllarda antioksidanlar gibi fonksiyonel bileşenlerin enkapsülasyonunda kullanılabilmektedir. Kırılgan olan lipozomların stabilitesini arttırmak için zıt yüklü bir polimerle tabaka tabaka kaplama tekniğiyle kaplanabilmektedir. Ancak sıvı halde çok fazla dayanıklı olmamaları ticari olarak kullanımlarını da sınırlandırmaktadır. Bu dezavantajları azaltmak için ekonomik bir yöntem olan püskürtmeli kurutma işlemi uygulanabilmektedir. Bu çalışmada, negative yüklü olan lipozomlar pozitif yüklü kitosan polisakkaritiyle kaplanmıştır. Yüksek basınçta homojenitör kullanılarak elde edilen lipozomların başlangıç partikül boyutu yaklaşık olarak 160 nm’dir ve kitosan konsantrasyonu (0.0025 - 0.5, [% w/v]) arttıkça partikül boyutu da artmakta ve 88 µm’ye kadar ulaşmaktadır. Yüzey yükü ise -36 mV’dan ~+50’a değişmiştir. Ortamda yetersiz miktarda polimer olmasından dolayı aynı polimerler birden fazla lipozom yüzeyine bağlanmış ve onların bir araya gelip dayanıklılıklarını kaybetmeklerine ve yapının çökmesine sebep olmuştur. Sonuçta faz ayrımı görülmüştür. ~0.4 (% w/v) kitosan konsantrasyonunda partikül boyutu en düşüktür (0.3 µm). Burada ζ-potansiyeli de sabit değere ulaşmıştır. Herhangi bir faz ayrımı söz konusu değildir. Çalışmada kara dut antosiyaninleri ekstrakte edilerek nano-lipozomla enkapsüle edilmiştir. Antosiyaninler de lipozomlar gibi anyonik olduğundan yüzey yükleri -27.6 ve -36.0 mV arasında değişmiştir. Ekstrakt konsantrasyonuna göre (0.005-1.0 % w/v) ortalama partikül boyutu artmaktadır. 173 ve 206 nm’ler arasında değişmiştir. Enkapsülasyon verimi ise %51.0 ve %84.7 arasındadır. Lipozomla enkapsülasyon ayrıca antosiyanin biyoyarlılığını arttırmıştır. Kitosan ile kaplanan ve kaplanmayan ekstrakt içeren ve içermeyen lipozomlar olarak %20 (w/w) maltodextrin (düşük DE20) taşıyıcı çözeltisi ile karıştırılarak püskürtmeli kurutma işlemine hazırlanmışlardır. Ancak, kitosan ile kaplanmayan lipozomların maltodekstrin ile karıştıktan hemen sonra “depletion” flokülasyon mekanizması sonucu istenen küresel yapısı bozulmuş ve sonucunda faz ayrımı gözlenmiştir. Bu nedenle bunlar püskürtmeli kurutucuda kullanılamaz hale gelmişlerdir. Diğer taraftan, kitosanla kaplanan lipozomların yapısında herhangi bir değişklik gözlenmemiştir. Kitosan hem ara yüzeyin kalınlığı artmış hem de elektriksel stabiliteyi arttırmıştır. Sonuçta püskürtmeli kurutucuda kurutularak toz haline getirilmiştir. Kurutma işlemi sırasında kitosanla kaplanan lipozomların fenolikleri yüksek sıcaklıktan koruduğu anlaşılmıştır (p < 0.05). SEM görüntülerine bakılınca üretilen toz örneklerin çoğunlukla küresel oldukları, yüzeyinde küçük çökük ve buruşukluklar bulunduğu anlaşılmıştır. Bu çökük ve buruşukluklara maltodekstrin sebep olmuştur. Tozların rehidrasyonu sonucunda partikül boyutu dağılımı ve yüzey yüklerinin orijinal sıvı formdaki dispersiyonlarla benzer olduğu görülmüştür. Elde edilen toz formdaki kitosan kaplı lipozomla enkapsüle edilen antosiyaninler çikolata konçlanmasının son bir saatinde eklenmiş ve böylece ticari kullanımı denenmiştir. Bu amaçla üç farklı konçlama sıcaklığı (40°C, 60°C, 80°C), ve alkalizasyon derecesi (4.5, 6, 7.5) seçilmiştir. Sonuçta maltodekstrinle karıştırılmış antosiyanin ve antosiyanin ektraktının kendisiyle kıyaslandığında kitosan kaplı lipozomla enkapsüle edilen antosiyaninlerin proses sırasında korunduğu belirlenmiştir.

Cocoa bean and its derivative products such as cocoa powder and chocolate are rich sources of procyanidins showing strong antioxidant capacity. In the first part of the thesis, change in stability, antioxidant capacity and bioaccessibility of procyanidins during cocoa powder production was studied. In this study, unroasted (UCB) and roasted (RCB) beans, natural (NCL) and alkalized (ACL) cocoa liquor and alkalized cocoa powder (ACP) were compared regarding their phenolic profile and antioxidant capacity related to industrial treatment such as roasting, grinding and alkalization. Total phenolic (TPC), and flavonoid contents (TFC) followed the order NCL > UCB > RCB ≈ ACL ≈ CP (significant difference, p < 0.05). In fact, there is a high correlation between TPC and TFC (R2= 0.97). Antioxidant capacity is strictly correlated to polyphenol content. DPPH assay followed the order NCL ≈ UCB > RCB > ACL ≈ CP. In terms of ORAC assay, the order was NCL > UCB ≈ RCB ≈ ACL ≈ CP (significant difference, p < 0.05). There is a higher correlation between TPC and ORAC values (R2= 0.97) than that of between TPC and DPPH values (R2= 0.70). Among different cocoa sources, natural cocoa liquor is the best polyphenol source due to containing the highest phenolic content and antioxidant capacity. Because grinding after roasting to obtain cocoa liquor caused a considerable increase in phenolic concentration owing to diffusion of phenols upon the breakdown of the cell wall. However, roasting and alkalization treatment resulted in remarkable loss in phenolic content due to oxidation and condensation reactions. Regarding phenolic profile, EC, C monomers, EGC, dimer B2 and trime C1 contents decreased during roasting and alkalization sharply. Grinding after roasting of cocoa bean to obtain cocoa liquor caused an increase in all those concentrations. However, C concentration inreased in the last step of cocoa powder production. This situation could be explained by isomerization of EC to C, epimerization of (+)-catechin to (-)-catechin or monomerization of procyanidins during production of cocoa powder. In the second part of the thesis, the changes in procyanidin profile, and antioxidant capacity during industrial chocolate production process, particularly roasting, conching, alkalization treatment were studies, and tried to optimize the process conditions by using Response Surface Methodology (RSM). A three-level central composite design (CCD) was used for the RSM studies, and 17 experimental settings were generated with three factors. The three factors chosen were roasting temperature, (115–155°C); alkalization concentration and conching temperature (60–80°C). Total phenolic and flavonoid content, and antioxidant capacity (EC50 and H-ORAC+L-ORAC), EC, C, Dimer B2 and Trimer C1 concentrations were selected as the responses. The experimental data was used to calculate the coefficients of the equations, which were used to predict the responses. Contour plots were generated by the model, as well. Analysis of variance indicated that the models showed no lack of fit for TPC, TF, EC50 and TAC values since p values of were higher than p > 0.05 (0.844, 0.538, 0.772, 0.435, 0.751, 0.828, 0.095, 0.634) and coefficients of multiple determinations, R2, being 0.955, 0.971, 0.776, 0.838, 0.5034, 0.907, 0.937, and 0.663 all indicate that models fit the experimental data points. p-values smaller than 0.05 for any of the terms in the models indicate that that term has a more significant effect on the respective responses. Regarding significant terms in equations obtained from the model, lineer term of RT and pH had negative effects on TPC, TFC, C, EC, Dimer B2 and Trimer C1 values in contrast to EC50 value. Interaction of RT and pH had positive effect on TF and Dimer B2 while that of RT and CT had negative effects on TAC and EC values. In addition, interaction of pH and CT affected negatively Dimer B2 value. On the other hand, quadratic term of RT had positive effect on TF whereas that had negative effect on TAC. Both quadratic terms of CT and pH affected EC and Dimer B2 in positive way, respectively. To determine the optimum process conditions, the experiment was carried out at the optimal conditions generated from the model. The experimental scores were satisfactorily close to the values predicted by the model. These results confirm the validation of the model. In the third part of the thesis, of a novel synbiotic dark chocolate enriched with Bacillus indicus HU36, maltodextrin and lemon fiber was developed and response surface methodology (RSM) was used to optimize the conditions. The aim of this study was to investigate the effects of probiotic Bacillus indicus HU36 and dietary fibers (maltodextrin and lemon fiber) addition on color and organoleptic quality properties of dark chocolate. The viability of B. indicus HU36 in dark chocolate was examined as well in the study. Three-level [1.5, 3.5, 5.5 (g/100g)], two factorial (maltodextrin, lemon fiber) Central Composite Design (CCD) was performed for developing synbiotic chocolate formulation. According to the results, B. indicus HU36 showed survival rate between 88-91% in samples. Descriptive sensory analysis (QDA®) and color analysis were performed to examine the effects of factors and their levels on quality attributes and describe developed chocolates in detail. While bacteria and dietary fiber addition did not show any negative effects on product sensory and color properties; dietary fiber addition improved some sensorial features significantly i.e. sweetness, firmness and adherence, The validation of the model had been accomplished by applying the conditions generated by the RSM model. This study is the first report on the use of B. indicus HU36 in potentially probiotic chocolate production. In the last part of the thesis, chocolate was fortified with encapsulated mulberry extract in chitosan-coated liposomes. Liposomes may be used as the delivery of various functional components such as flavors, antioxidants, and antimicrobials in food industry. Recent studies showed that liposomes may be promising delivery systems for phenolic compounds. However, the difficulty of maintaining the structural integrity of liposomes in aqueous dispersion represents a challenge for their commercialization. The aim of this study was encapsulating mulberry extract in liposome delivery systems, and fortification of chocolate with those encapsulated extract. Fine-disperse anionic lecithin liposomes were prepared by high pressure homogenizator. To increase stability, liposomes containing mulberry extract was coated with cationic chitosan by using the layer-by-layer depositioning method. Upon addition of chitosan (0-0.5 w/v %) to liposomal dispersions, the surface charge changed from -36 mV to ~+50 mV. The particle diameter of uncoated liposomes was ~160 µm and increased to around 88 µm after addition of low amounts of chitosan (0.0025 to 0.5, [w/v %]). The mean diameter of particles changes according to the chitosan concentration added. At a chitosan concentration of ~0.4 (w/v %), where the ζ-potential had reached a constant value, the mean diameter was the lowest (0.3 µm). No phase separation and aggregated structures were observed. Mulberry extract was entrapped in liposomes. Liposomes with extract had generally higher z-average diameters compared to liposomes that did not contain any extract. Particle diameters of liposomes with extract varied between 173 and 206 nm depending on the extract concentration (0.005 to 1.0 w/v %) at the same homogenization pressure. Entrappment efficiency changed between 51.0 and 84.7% for those concentrations. All liposomes had negative surface charges whether they contained extract or not, ranging between -27.6 and -36.0 mV. Since phenolic compounds are negatively charged, they contribute to an enhanced negative charge of liposomes. In addition, bioavailability of extract in chitosan coated liposome was increased. To facilitate spray drying of liposomes, liposomes were mixed with low molecular weight maltodextrin (20%, w/w). However, uncoated liposomes with and without anthocyanin were broken down after maltodextrin addition due to extensive flocculation. In contrast, chitosan-coated liposomal dispersions were stabile since chitosan acted as a “protective coat”. During spray drying, chitosan layer protected anthocyanins compared to pure anthocayin extract (p < 0.05). % retentions of total phenolic content and anthocyanin content were 42.9% and 39.4%, respectively. SEM images showed that powders prepared from coated liposomes with maltodextrin were mostly spherical with some small indentations and wrinkles on their surfaces. Most of the particles had average diameter of less than 5 μm. Dents and wrinkles are caused by maltodextin as a carrier during spray-drying. After reconstitution, particle size distributions and surface charge of samples were similar to those of original dispersions. Finally, liposome powders containing extract, chitosan-coated liposome powders containing extract, extract mixed with maltodextrin and pure extract were added to chocolate liquor during the last one hour of conching stage. For experimental design, three different alkalization degrees (4.5, 6, 7.5) and conching temperatures (40°C, 60°C, 80°C) were selected. Based on statistical analysis, formulation, pH, and temperature, interactions of formulation*pH, formulation*temperature, pH*temperature, formulation* temperature*pH have significant effects on ACN loss (p < 0.05). Encapsulation of extract in chitosan coated liposomes protected ACN content.