Rhodobacter Capsulatus Bakterisinin Sıcak Ve Soğuk Stresi Tepkilerinin Proteomik Analizleri Ve Sıcağa Dayanıklı Mutantlarının Evrimsel Mühendisliği

Abstract

Hidrojen biyolojik olarak üretilebilen gelecek vadeden alternatif bir enerji kaynağıdır. Sülfür bakterisi olmayan, mor bakteri, Rhodobacter capsulatus azotun sınırlı olduğu durumlarda fotoheterotrofik koşullarda basit organik asitler gibi karbon kaynaklarını indirgeyerek hidrojen üretebilir. Biyolojik hidrojen üretimi için kullanılmakta olan açıkalan-kapalı fotobiyoreaktörler direk güneş ışığı altına yerleştirilirler; buna bağlı olarak, gün içinde sıcaklık değişimlerine maruz kalırlar. Bu problemi çözmek için; bu çalışmada R. capsulatus bakterisinin sıcağa dayanıklı (42°C’ ye kadar) mutantları evrimsel mühendislik yaklşımıyla geliştirilmiştir ve ileri metabolik mühendislik çalışmaları için sıcak ve soğuk stresinin R. capsulatus hidrojen üretim metabolizması üzerine etkileri proteomik yaklaşımla çalışıldı. R. capsulatus bakterisinin DSM 1710 soyuna EMS mutagenezi uygulanarak, onbir mutant soy oluşturuldu ve 42°C’ de solunum koşullarında seçildi. Mutantların genetik kararlılığı incelendi ve sekiz mutantın genetik olarak kararlı olduğu görüldü. Sıcaklık stresine dayanıklı bu sekiz suşun tamamı 42°C’de büyüyebilmenin yanısıra fotosentetik ortamda da büyüyebilmektedirler. Ayrıca, mutant soyların hidrojen üretimleri analiz edildi, analiz sonucunda beş mutantın yaban tip DSM 1710 soyundan daha fazla hidrojen ürettiği; üç mutantın ürettikleri hidrojenin hacim olarak yaban tipten daha az olduğu tespit edildi. En yüksek hidrojen üretim kapasitesine sahip olan mutantın (B41) ürettiği hidrojen miktarının yaban tipin hidrojen üretiminden % 11.7 daha fazla olduğu; öte yandan, hidrojen üretimi en düşük olan mutantın (A52) yaban tipten %11.2 daha az hidrojen ürettiği görüldü. Bu sonuçlar, endüstriyel açıdan önemli özelliklerin geliştirilmesinde yaygın olarak kullanılan evrimsel mühendislik yöntemiyle R.capsulatus bakterisinde sıcaklık direncinin geliştirilebilir olduğuna işaret etmektedir. Proteome analizleri sonucunda elde edilen veriler, sıcak ve soğuk stresine karşı birçok proteinin aktive olduğu veya ekspresyonun azaldığı görülmüştür. Sıcak şoku durumunda ekspresyonu artan proteinlerin sıcak şoku proteinleri, membran proteinleri, ribozomal proteinler ve elektron transfer zinciri proteinleri olduğu görülmüştür. Bu proteinlerin yanı sıra hidrojen üretim metabolizmasında görevli proteinlerin ekspresyonu sıcak şoku karşısında azalma göstermiştir. Bu durum sıcak şoku koşullarında hidrojen üretiminin azalmasına neden olmaktadır. Soğuk koşulları altında ekspresyonu artan proteinler soğuk şoku proteinleri, ayrıca sıcak şoku koşullarında olduğu gibi membran proteinleri, ribozomal proteinler ve elektron transfer zinciri proteinleridir. Hidrojen üretim metabolizması proteinleri soğuk şoku koşullarında da azalma göstermiştir. Soğuk şoku koşullarında hidrojen üretimi azalmıştır.

Hydrogen is a promising alternative energy source which can be produced biologically. Rhodobacter capsulatus, a non-sulphur purple photosynthetic bacterium, can produce hydrogen in nitrogen-limited conditions under photoheterotrophic conditions by using reduced carbon sources such as simple organic acids. Outdoor closed photobioreactors used for biological hydrogen production are located under direct sunlight, as a result; bioreactors are exposed to temperature fluctuations during day time and hydrogen production is affected considearbly because of day and night temperature changes. To overcome this problem, temperature-resistant mutants (up to 42°C) of R. capsulatus were gererated by evolutionary engineering approach, and the effect of heat and cold stress on the R. capsulatus hydrogen production metabolism was studied by proteomics approach for further metabolic engeneering studies. Eleven mutant strains of R. capsulatus DSM 1710, generated by ethyl methane sulfonate (EMS), were selected at 42°C under respiratory conditions. The genetic stability of the mutants was tested and eight of them were genetically stable. All of the eight mutant strains could grow under photosynthetic conditions along with growth ability at 42°C. Moreover, hydrogen production of mutant strains was analyzed; five of the mutants were producing higher amounts of hydrogen when compared to DSM 1710 wild-type strain and three mutants were producing less hydrogen in volume. The mutant whose hydrogen production was higher than those of the other mutants (B41) produced 11.7 % more hydrogen compared to wild type, and the mutant with lowest hydrogen production (A52) generated 11.2 % less hydrogen compared to the wild type. These results indicated that heat resistance of R. capsulatus can be improved by evolutionary engineering which is a useful tool to improve industrially important microbial properties. From the data gathered from proteomic analysis, it was seen that a number of proteins expressed or repressed as a response to heat and cold stress. Proteins whose expression increased under heat shock conditions are heat shock proteins, membrane proteins, ribosomal proteins, and electron transfer chain proteins. Along with these proteins, proteins occupied with hydrogen production metabolism were decreased in expression. This situation leads to decrease in hydrogen production under heat shock conditions. Under cold shock conditions, proteins whose expression increased are membrane proteins, ribosomal proteins, cold shock proteins, and electron transfer chain proteins. Proteins of hydrogen metabolism decreased as in the case of heat shock. So, hydrogen production decreased under cold shock conditions.