Kif15 İn Moleküler Diseksiyonu

Abstract

Kinezin motor protein ailesinin bir üyesi olan Kif15, mitotik hücrelerde, diğer motor proteinler tarafından yaratılan kuvvetlere karşı koyarak mitoz mekiğinin stabilitesini sağlar. Kif15’in motor bölgesi mikrotübüllerle etkileşirken, kuyruk kısmı –mitozun evresine bağlı olarak- mikrotübüller veya aktin filamentleriyle etkileşir. Kif15 nöronlarda da bulunur ama buradaki fonksiyonu halen bilinmemektedir. Organizmanın gelişimi sırasında merkezi sinir sisteminden menşe alan nöronların görevlerini yerine getirebilmeleri için hedef yerlerine ulaşmaları, yani göç etmeleri gerekmektedir. Nöronlar hedef yerlerine geldiklerinde, nöronal göçte etkili diğer motor proteinlerinin yarattığı kuvvetler nötralize edilmelidir. Kif15’in de motor kısmıyla mikrotübüllere bağlanıp, kuyruk kısmıyla da diğer mikrotübüller ve/veya aktin filamentleriyle etkileşerek bu ağın stabilizasyonunu sağladığı ve böylece nöronal göçün durdurulmasında önemli rol oynadığı düşünülmektedir. Bu projenin amacı, Kif15’in özellikle yukarıda bahsedilen sitoiskelet elemanlarıyla etkileşen bölgelerini ayrı ayrı tanımlamak, ve sonunda nöronal göçün ve bu sırada meydana gelen anormallikler sonrası oluşan Lissencephaly gibi nöronal hastalıkların moleküler mekanizmasını anlamaktır. Bu amaçla ergin bir sıçan disekte edildi be beyin bölgesi alındı. Bu beyin kullanılarak total RNA izolasyonu yapıldı. Elde edilen RNA’dan cDNA sentezlendi ve diziye özel primerler kullanılarak Kif15’in özelleşmiş fonksiyonu olan bölgeleri klonlandı. Klonlama vektöründeki alt bölgeler dizileri doğrulandıktan sonra, hücre kültürü çalışmalarında kullanılmak üzere fluoresan ekspresyon vektörlerine aktarıldı. Şu an sürdürülmekte olan deneyler HeLa ve primer nöron hücrelerinin bu vektörlerle transfeksiyonunu, immunositokimyasal boyama ve fluoresan mifroskobu çalışmalarını içermektedir.

Kif 15, member of kinesin motor protein family, opposes to the forces generated by other motors that move microtubules (MTs) to maintain the separation of spindle poles in mitotic cells. Kif15 motor domain interacts with MTs, while its tail domain interacts with other MTs or actin filaments, depending on the phase of the mitosis. Kif15 is also found in neurons, but there its function is still a mystery. Many neurons are born far from their ultimate destinations and have to migrate to their target places. When neurons arrive to their target places, the forces generated by other motors that affect migration, have to be neutralized. It is thought that Kif15 crosslinks MTs and microfilaments, and as a result they oppose the capacity of other motors to generate independent MT movements. The aim of the project is to specifically identify the domains of Kif15 that interact with the above mentioned cytoskeletal elements, and ultimately to understand the molecular mechanisms of neuronal migration and neuronal diseases caused by migration abnormalities. For this reason, an adult rat was dissected and whole brain was obtained. RNA isolation was performed from the brain. cDNA was synthesized by using the total RNA. Then, functional domains of Kif 15 was amplified bu using sequence specific primers. Sequences of the clones were verified and then, these domains were subcloned into fluorescent expression vectors in order to be used in cell culture studies. Ongoing experiments include transfection of HeLa and primary neurons by GFP constructs, immunostaining and fluorescent microscopy studies.