Metagenomik Yöntem Kullanılarak Selüloz Parçalayan yeni Enzimlerin Keşfedilmesi

Abstract

Fosil yakıtlar tükenebilir kaynaklar olmakla birlikte tüketimleri çevreye zararlı kimyasalların salımına neden olmaktadır. Fosil yakıtların çevreye olan zararlarını azaltmak ve enerjinin sürdürebilirliğini sağlamak için alternatif enerji kaynaklarının geliştirilmesi gerekmektedir. Selülozik biyokütlelerin parçalanması ile elde edilen biyoyakıt enerji gereksiniminin karşılanması için yüksek potansiyelli bir alternatif olarak görülmektedir. Fakat bu alanda yürütülen yoğun araştırmalara rağmen sürdürülebilir ve ekonomik açıdan uygulanabilir biyoyakıt üretimi sağlanamamıştır. Bunun sebebi, selülozik yapının parçalanamaya dirençli yapısıdır. Günümüzde biyoyakıtın endüstriyel ölçüde üretiminin yapılmasının önündeki en büyük engel optimum düzeyde çalışan yüksek kaliteli enzimlerin eksikliğidir. Biyoyakıt üretiminin yanı sıra selülazlar birçok alanda kendilerine yer bulmaktadır. Selülazların sıklıkla kullanıldığı alanlar gıda endüstrisi, hayvan yemi üretimi, tekstil ve çamaşır sektörü, kimya sektörü, kağıt ve kağıt hamuru endüstrisi, atıkların parçalanması, tıp ve farmasötik endüstrisi, protoplast elde edilmesidir. Selülozun tamamen parçalanması birden fazla enzimin eş zamanlı çalışmasını gerektirmektedir. Selülozu parçalamakla görevli enzimler, selülazlar, yapılarına ve aksiyon mekanizmalarına bağlı olarak üç grupta sınıflandırılmışlardır: endoglukanaz, ekzoglukanaz ve -glukozidaz. Endoglukanazlar polisakkarit zincirinin iç bölgelerinde rastgele hidroliz yaparak değişik uzunlukta oligosakkaritler oluştururlar. Ekzoglukanazlar oluşturulan farklı uzunluktaki oligosakkaritlerin indirgenen ve indirgenmeyen ucundan sellobioz unitlerini hidroliz ederler. -glukozidazlar ise meydana gelen sellobiozun ve sellodekstrinin glikoza parçalanmasından sorumlu enzimlerdir. Günümüzde amacına uygun optimum şartlarda çalışan enzimlerin yetersizliğinden dolayı selülazların ticari kullanımı sınırlıdır. Yeni enzimlerin keşfi için dikkat çeken yöntemlerden biri doğal çeşitliliğin uygun amaç doğrultusunda taranmasıdır. Her türlü çevresel koşulda yaşamaya adapte olmuş mikroorganizmalar yeni enzimlerin keşfi için önemli kaynak teşkil etmektedir. Metagenomik yaklaşım, çevresel örneklerden direkt DNA izolasyonunu içeren, bu sebeple kültivasyondan kaynaklanan genetik bilgi kayıplarını en aza indirgeyen bir yöntemdir. Bu yöntem ortamda bulunan tüm mikroorganizmanın genetik materyalinin kazanımını sağlamaktadır. Yapılan çalışmada metagenomik yöntem kullanılarak selüloz parçayan yeni enzimlerin keşfi amaçlanmıştır. Metagenomların eldesi için çeşitli ortamlardan örnekler elde edilerek metagenomik DNA izolasyonları yapılmıştır: Bu örnekler Dalaman Kaynak Suyu, Dalaman Gölü, Emet Kaplıcaları, Kuzuluk Kaplıcaları, Emet Kaplıcaları ve Dalaman Gölü’nde bekletilen samanlar, çiftlikte yetiştirilen ve TÜBİTAK MAM kampüsünden toplanan çekirgeler ve TÜBİTAK MAM kampüsünden alınan çürümeye başlamış çimendir. Metagenomik DNA’ların örneklerden izolasyonu ve gerekli olduğu durumlarda elde edilen DNA’ların kontaminantlardan arındırılması için ZR Fecal DNA MiniPrep™, Meta-G-Nome™ DNA Isolation Kit ve Genomic DNA Clean & Concentrator kitleri kullanılmıştır. DNA miktarı ve kalitesi agaroz jel elektroforez sitemi ve spektometrik yöntemler kullanılarak tayin edilmiştir. İzolasyonu yapılan DNA’lar metagenomik kütüphanelerin oluşturulmasında kullanılmıştır. Kütüphane oluşturulurken TruSeq Nano DNA Library Prep Kit (Illumina, USA) üretici firmanın tarifine uygun şekilde kullanılmıştır. HiSeq2500 (Illumina, ABD) dizileme sistemi ile tüm metagenom sekans dizilemesi gerçekleştirilmiştir. HiSeq2500 (Illumina, ABD) dizileme sistemi ile okunan parçaların birleştirilmesinde, filogenetik çalışmalarda ve gen anotasyonunda biyoenformatik araçlardan yararlanılmıştır. Okunan parçalar birleştirilirken Velvet Assembler (v1.2.07) programı kullanılmıştır ve analizle sonucu yaklaşık 68 gigabazlık data oluşturulmuştur. PhyloSift programı kullanılarak örneklerdeki mikrobiyal çeşitlilik belirlenmiştir. MetaGeneMark programı kullanılarak metagenomda bulunan açık okuma pencereleri belirlenmiştir. Belirlenen açık okuma pencereleri selülaz genlerinin belirlenmesinde kullanılmıştır. Selülaz genleri araştırılırken genlerde bulunan selüloz bağlanma bölgeleri ve glikozit hidrolaz dikkate alınmıştır. Analizler sonucu metegenomlarda 1238 selülaz geni olduğu görülmüştür. Selülaz olarak anotasyonu yapılan genlerden 63 tanesi enzim keşfi için seçilmiştir. Her aday gene uygun özel primer çifti tasarlanmıştır ve uygun reaksiyon koşullarında metagenomik DNA’lar şablon olarak kullanılarak genler çoğaltılmıştır. Seçilen 63 genden 54 tanesi başarıyla çoğaltılmıştır. Amplifikasyonu yapılan genler EZ-Fusion™ Cloning Kit’i üreticinin protokolüne uygun bir şekilde kullanılarak daha önce restriksiyon enzimi ile lineer hale getirilen pET-22b(+) vektörüne klonlanmıştır. Aday geni içeren pET-22b(+) vektörlerinin, proteinlerin ekspresyonu için, E. coli BL21 (DE3) suşuna transformasyonu yapılmıştır. Transformasyon ısı şoku yöntemi kullanılarak kimyasal olarak kompetent hale getirilmiş hücreler ile yapılmıştır. Hücrelerin hedef geni içerdiğini göstermek için koloni PZR yapılmıştır. Yapılan doğrulama sonucunda 54 genin başarı ile E. coli BL21 hücrelerine klonlandığı gözlemlenmiştir. Rekombinant protein üretimi besi ortamına 1 mM IPTG eklenerek indüklenmiştir. Aynı koloniye ait IPTG ile indüklenen hücreler ve indüklenmeyen hücrelerin protein profilleri SDS-PAGE ile görüntülemiştir. Aday genlerin SDS-PAGE ile analizleri sonucu 22 proteinin başarı ile üretildiği gözlemlenmiştir. Aday genlerinden başarıyla ekspres edilen 22 tanesi biyokatalitik aktivite için test edilmiştir. Hücrelerin uygun tampon ile sonikasyonundan sonra ham enzim elde edilmiştir. Endoglukanaz ve ekzoglukanaz aktivitesi için CMC substrat olarak kullanılırken, -glukozidaz için pNPG kullanılmıştır. Aktivite tayini CMC’ye karşı aktivite gösteren bir enzimin varlığı gösterirken, pNPG’ye aktivite gösteren enzim gözlemlenmemiştir. CMC’ye karşı aktivite gösteren gen, 969 bp uzunluğunda olup, protein boyutu 34,40 kDa olarak hesaplanmıştır. BLAST analizi, bulunan genin daha önce bilinen Rhodanobacter fulvus’a ait endoglukanaz geni (NCBI Reference Sequence: WP_007079969.1) ile %100 benzer olduğunu göstermiştir. Genin spesifik aktivitesinin belirlenmesi için HisPur™ Cobalt Purification Kit (Thermo Fisher Scientific) kullanılarak protein saflaştırması yapılmıştır ve işlem için üreticinin tarifi kullanılmıştır. Saflaştırılan proteinin miktar tayini Bradford yöntemi kullanılarak yapılmıştır. Saflaştıran protein enzim aktivite testi için kullanılmış ve spesifik aktivite spektrometrik ölçümlerden yararlanılarak belirlenmiştir. Bulunan endoglukanaz enziminin spesifik aktivitesi bir miligram protein başına 0,44 ünite olarak hesaplanmıştır.

Fossil fuel is a finite energy source and use of fossil fuels releases harmful chemicals to environment. To fulfill energy requirement, alternative energy sources that can replace fossil fuel must be developed. A high potential environmental friendly alternative is bio-fuel produced from cellulosic biomass. Despite of high number of biofuel researches, production of sustainable and economical biofuel remains a challenge due to recalcitrance of cellulosic materials. The major obstacle for industrial-scale production of biofuel is the inefficient degradation of plant material due to absence of enzymes that catalyze efficient hydrolysis at optimum conditions. Fully degradation of cellulose requires synergetic action of a complex of enzymes for optimized saccharification. Cellulases, which catalyze cellulolysis, are classified into three groups according to their structure and mechanism of action: endoglucanases, exoglucanases, and β-glucosidases. Unfortunately, commercial biocatalysis is insufficient due to the lack of enzymes with optimal performance for specific applications. A powerful approach, which draws attention lately, for discovery of new enzymes with optimum performance is screening of natural diversity. Microorganisms, which adapted to a wide range of environmental conditions, serve as a good source. Metagenomic approach, which comprises the direct extraction of genomic DNA from environmental samples, can prevent loss of diversity resulting from cultivation, and allows recovery of genomes of all microorganisms present in a given niche. In this study, the aim was identification of novel cellulolytic genes using metagenomic approach. Environmental samples used in the study comprised water samples from Dalaman Spring, Dalaman Lake, Emet Hot Spring, and Kuzuluk Hot Springs, straw samples that were incubated in water for enrichment of cellulolytic microorganisms, grasshoppers obtained from TUBITAK MAM campus and commercial farm, and grass compost taken from TUBITAK MAM campus. The metagenomic DNA extraction and DNA clean-up (if required) were performed using commercial kits. The isolated DNAs were used for construction of metagenomic library with next-generation sequencing technology. Bioinformatic tools were used for assembly of reads, phylogenetic studies, and gene annotations. Total of 63 candidate cellulase genes were selected from annotated for further analysis. Candidate genes, which were amplified from metagenomic DNA, were cloned into E. coli BL21 (DE3) for production of recombinant protein. 22 of 63 candidate proteins was expressed successfully and screened for biochemical activity against cellulose. Two different substrate, CMC and pNPG, were used for screening of endoglucanases, exoglucanases, and β-glucosidases. Activity assay revealed one active enzyme against CMC, while no active protein that hydrolyzes pNPG was found.