Phage Dısplay Teknolojisi İle Kristal Yüzey Spesifik Peptidlerin Tanımlanması

Abstract

Büyük ve küçük proteinlerin, kemik, diş dokuları ve bakteri partikülleri gibi biyolojik sert dokuların, sentez ve oluşumu gibi biyomineralizasyonları boyunca, temel rolleri vardır. Tüm bu olaylar, minerallerin moleküler olarak tanınması, onların kataliz/sentez ve biyomineralizasyon boyunca geçici olarak alan içine dağılmış bir grup protein tarafindan kendiliğinden düzenlenmesi (self-assembly), yoluyla gerçekleşir. Metal, metal oksit, karbonat, sülfit ve atomik kompozisyon, kristal yapı, nano- ve mikro-yapı ile fiziksel özelliklerde değişiklik gösteren yapılar, biyomineralize dokularin inorganik bileşenlerini olşturur. Bu çalişmada, kristal yüzey spesifik peptidleri seçmek üzere, M13 Phage Display sistemini kullanarak, phage display teknolojisi benimsenmiştir. Seçim için, tek kristal safirin (α-alumina, Al2O3), [110] ve [001] olmak üzere iki farklı kristal yüzeyi kullanılmıştır. İnorganik yüzeye bağlanan peptidlerin seçimi için adapte ettiğimiz, New England BioLabs tarafından geliştirilmiş olan Ph.D.-C7C kütüphanesi ile, moleküler biyolojik protokol kullanılarak safir spesifik peptidler elde edilmiştir. Seçim süreci boyunca, yüzeye bağlanan herhangibir faj tercihli olarak ortamda tutulmuş, spesifik olmayan fiziksel olarak tutunan fajlar yıkanarak ortamdan uzaklaştırılmıştır. Proses, safire bağlanmasi istenen peptidleri ortaya koyan fajların zenginleştirilmesi için, 3-4 kez tekrarlanmiştır. İnorganik yüzeyden bağlanan fajlarin yetersiz bir şekilde elusyonu gibi, seçim protokolünün muhtemel dezavantajlarını gidermek amacıyla, yeni bir protokol uygulanmiştır. Seçilen sekansların karakterizesyonu için, pI ve yük gibi fizikokimyasal özellikleri ile hidrofilite değerlendirilmesi yapılmıştır. Bağlanma özellikleri izlenerek, immünoboyama temelli floresan mikroskopi çalışmaları ile, seçilmiş peptidler güçlü, orta ve zayıf bağlanma özellikli olarak üç gruba ayrılmıştır. Sekansların daha kapsamlı özelliklerinin belirlenmesi, atomik kuvvet mikroskopisi kullanılarak, gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmalar, seçilen peptidlerin kristalografik yüzey spesifik doğası ile ilgili bilgiler vermiştir.

Proteins, large and small, play major roles during biomineralization, i.e., in the synthesis and formation of biological hard tissues such as bone, dental tissues and, bacterial particles. This is accomplished via molecular recognition of minerals, their catalysis/sythesis and, self-assembly by a collection of proteins that are temporally and spatially distributed during the biomineralization processes. Inorganic components of the biomineralized tissues include metals, metal oxides, carbonates, sulfides and, semiconductors that vary in atomic composition, crystal structure, nano- and micro-structure and, physical properties. In this research, in an attempt to select crystal–surface specific peptides, we adopted phage display technology using M13 Phage Display system. Single crystals of sapphire (α-alumina, Al2O3 ) in two different crystal orientations [110] and [001] were used as the substrates for selection. Sapphire specific peptides were recovered using a molecular biological protocol with Ph.D.-C7C library provided by New England BioLabs, that we adapted for the selection of inorganic-binding peptides. During the stages of selection, any phage that binds to the surface is preferentially retained and, non-specific physisorbed phages are washed out. The process is repeated 3-4 rounds to enrich for the phages displaying the desired sapphire-binding peptides. A new protocol was introduced to overcome possible disadvantages of the selection procedure like inefficient elution of the bound phages from the inorganic surface. Characterization of the selected sequences was performed both by evaluating their physicochemical properties such as pI, charge and hydrophilicity. By following their binding properties, the selected peptides were classified in three groups as strong, moderate and weak binders as aresult of immunolabelling based fluorescence microscopy studies. Further verifications on the properties of the sequences, were performed by use of atomic force microscopy experiments. These studies provided insights into the nature of crystallographic surface specific binding of selected peptides.