Makroalglerden saflaştırılan ade inhibitör peptitlerin karakterizasyonu ve nanoenkapsülasyonu: Biyoaktivitelerinin ve stabilitelerinin araştırılması

Abstract

Makroalgler, denizel ortamda yetişen karmaşık hücreli canlılardır ve protein, karbonhidrat, lipid, mineral ve fenolik maddeler açısından zengin bir kaynaktır. Özellikle protein açısından umut verici olan makroalglerin insan tüketimi için uygun olduğu kanıtlanmıştır. Makroalglerin ilgi çekici diğer bir özelliği ise sağlık etkileri gösteren biyoaktif bileşikleri içermesidir. Bu bileşikler içerisinde biyoaktif peptitler insanlarda bağışıklık, kardiyovasküler ve sinir sistemleri dahil olmak üzere düzenleyici süreçlerde rol oynamaktadır. Makroalgler, yüksek değerli bileşikleri içermelerine rağmen, hücre duvarlarından dolayı bu bileşiklerin ekstraksiyonu ve kullanılması zor olabilmektedir. Ekstraksiyon verimini artırmak için osmotik şok, ultrases, yüksek basınç, sub-kritik gibi mekanik ya da enzim destekli parçalama gibi biyolojik uygulamalar bulunmaktadır. Ayrıca ekstrakte edilen proteinlerin hidrolizi ile birlikte açığa çıkan biyoaktif peptitlerin saflaştırılması ve tanımlanması da önemlidir. Hassas yapıya sahip olan peptitlerin gıda işleme ve gastrointestinal sindirim sırasında karşılaşabilecekleri sert koşullar karşısında stabilitelerinin korunabilmesi için enkapsülasyon yöntemleri başarıyla uygulanmaktadır. Tez beş iş paketinden oluşmaktadır. İlk iş paketinde 119O149 numaralı 3501 TÜBİTAK Projesi kapsamında Türkiye'nin Ege Denizi kıyılarından toplanan Ulva rigida (yeşil makroalg), Laurencia obtusa (kırmızı makroalg) ve Padina pavonica (kahverengi makroalg) kimyasal kompozisyonu araştırılmıştır. Bu üç alg toplam protein, karbonhidrat, kül, lipit ve lif açısından incelenmiş ve birbiri ile karşılaştırılmıştır. Kuru bazda en yüksek protein ve lipit içeriği L. obtusa'da (sırasıyla, %11,65 ve %1,69), en yüksek karbonhidrat ve lif içeriği U. rigida'da (sırasıyla, %52,82 ve %17,56) ve en yüksek kül içeriği P. pavonica'da (%47,30) tespit edilmiştir (p<0,05). Bunun yanı sıra kromatografik yöntemler ile mineral madde kompozisyonu, çözünür şeker, yağ asiti ve amino asit profilleri de belirlenmiştir. Mineral madde profiline göre Mg ve K başlıca mineraller olarak tespit edilmiştir. Makroalgler için önemli olan ağır metal miktarları (Ag, Al, Ni, Cd, Pb) ise toksik seviyenin altında bulunmuştur. Araştırılan makroalgler, yağ asidi profiline göre palmitik (%48,55- 66,37), oleik (%8,41-20,92) ve linoleik (%2,53-12,92) asitlerce zengindirler. Bunun yanı sıra makroalglerin esansiyel amino asitler (lisin gibi) açısından da zengin bir kaynak olduğu söylenebilmektedir. İkinci iş paketinde U. rigida (URPE), L. obtusa (LOPE) and P. pavonica (PPPE)'dan ultrases ve enzim destekli protein ekstraksiyonu gerçekleştirilerek, elde edilen proteinin karakterizasyonu, teknofonksiyonel özellikleri ve in vitro gastrointestinal sindirim öncesi ve sonrası biyoaktif özelliklerinde meydana gelen değişimler incelenmiştir. U. rigida için ultrases ve enzim destekli ekstraksiyon koşulları (ultrases uygulama süresi, enzim/substrat (E/S) oranı ve ekstraksiyon sıcaklığı) yanıt yüzey metodolojisi kullanılarak optimize edilmiştir. Varyans analizine göre protein, toplam fenolik madde miktarı (TFMM) ve antioksidan aktivite (CUPRAC ve ABTS yöntemleri ile) için belirleme katsayısı (R2) sırasıyla, 0,96, 0,98, 0,92 ve 0,81 olarak bulunmuştur. Elde edilen R2 değerleri uygulanan modelin güvenilir ve kullanılabilir olduğunu göstermiştir. Optimum ekstraksiyon koşulları 0,50 dakikalık ultrases uygulama süresi, E/S 1,0 ve ekstraksiyon sıcaklığı 26,94 ºC olarak belirlenmiştir. Elde edilen koşullar L. obtusa ve P. pavonica için de uygulanmıştır. Optimize edilen ultrases ve enzim destekli ekstraksiyon ile U. rigida, P. pavonica ve L. obtusa için elde edilen ekstraksiyon verimleri srıasıyla %74,21, %63,20 ve %94,74 olarak tespit edilmiştir. Makroalgal proteinlerin in vitro sindirilebilirliği URPE için %84,35, PPPE için %94,09 ve LOPE için %90,26'dır. Makroalgal protein ekstraktlarının (MPE) TFMM 19,32 mg GAE/g ile 77,86 mg GAE/g arasında bulunmuştur ve en yüksek TFMM LOPE'nindir. MPE'nin antioksidan aktiviteleri ABTS yöntemine göre 143,76 mg TE/g ile 251, 29 mg TE/g arasında iken, CUPRAC yöntemine göre 22,40 mg TE/g ile 74,69 mg TE/g arasında tespit edilmiştir. MPE'nin antioksidan aktiviteleri her iki yönteme göre PPPE>LOPE>URPE şeklinde sıralanmaktadır (p<0,05). En yüksek anjiyotensin dönüştürücü enzim (ADE) inhibitör aktivite PPPE (%13,01) gösterirken en düşük aktiviteyi LOPE (%0,30) sergilemiştir. In vitro gastrointestinal sindirim sonrası antioksidan aktivite de azalma meydana gelirken ADE inhibitör aktivitenin ise arttığı gözlenmiştir. Makroalgal proteinlerin teknofonksiyonel özellikleri değerlendirildiğinde, su tutma kapasitesi için sıralama URPE (%91,55)>LOPE (%70,27)>PPPE (62,09) şeklindedir. Yağ tutma kapasitesileri %182,32 (LOPE) ile %410,13 (PPPE) arasındadır (p<0,05). En yüksek emülsifiye edici aktivite LOPE'de (%46,33) tespit edilirken onu sırasıyla URPE (%33,26) ve PPPE (%11,21) takip etmiştir (p<0,05). En yüksek emülsiyon stabilitesi URPE'dedir (%20,46). Köpürme kapasiteleri URPE için %28,92, LOPE %5,61, PPPE için %16,81'dir. URPE ve PPPE ~%11 köpürme stabilitesine sahipken, LOPE köpürme stabilitesi göstermemiştir. MPE'lerin SDS-PAGE analizine göre <17 kDa'dan düşük moleküler ağırlığına sahip peptit içerdikleri, PPPE'nin buna ek olarak 35, 48 ve 75 kDa'larda bantlara sahip olduğu görülmüştür. DSC sonuçlarına göre denatürasyon sıcaklıkları ise LOPE(115,50 ºC)>URPE (94,58 ºC)>PPPE (69,51 ºC) olarak tespit edilmiştir. Üçüncü iş paketinde MPE'lerden ADE inhibitör peptitlerin saflaştırılarak, peptit dizilimleri tanımlanarak, in silico ve in vitro sitotoksisiteleri araştırılmıştır. Biyoaktif peptit eldesi için ilk basamak olarak, pepsin ve tripsin enzimleri ile enzimatik hidroliz gerçekleştirilmiştir. Hidroliz dereceleri URPH (%83,1)>LOPH (%79,0)>PPPH (%78,8) olarak sıralanmıştır. Hidrolizasyon sonrası elde edilen hidrolizatların ADE inhibitör aktivitelerinin ekstraktlara göre arttığı görülmüştür. URPH, LOPH VE PPPH'nin ADE inhibitör aktiviteleri sırasıyla %83,1, %79,0 ve %78,8 olarak tespit edilmiştir. Protein hidrolizatları 3,5 ve 10 kDa molekül ağırlığına sahip ultrafiltrasyon tüplerinden geçirilerek fraksiyonlarına ayrılmıştır. Tüm makroalgler için 3 kDa'nın altındaki molekül ağrılığına sahip fraksiyonlar, en yüksek ADE inhibitör aktivite sergilemiştir. En yüksek ADE inhibitör aktiviteye sahip <3 kDa'nın altındaki fraksiyonlara iyon değişim kromatografisi ile ileri saflaştırma uygulanmıştır. İyon değişim kromatografisinden sonra URPH ve LOPH için ADE inhibisyonlarında artış tespit edilirken, PPPH'nin ADE inhibitör aktivitesinde düşüş olduğu gözlenmiştir. Bu nedenle, en yüksek ADE inhibitör aktivite gösteren URPH-F1 (%82,0), LOPH-F2 (%81,0) ve PPPH (%78,8)'nin LC-MS/MS ile peptit dizilimleri tanımlanmıştır. Tanımlanan peptit dizilimleri BIOPEP ve PeptideRanker araçları ile analiz edilerek, in silico'daki potansiyel biyoaktif özellikleri incelenmiştir. BIOPEP sonuçlarına göre, URPH-F1'den 20 adet ADE inhibitör peptit tanımlanmıştır. PeptideRanker skorları 0,95'in üstünde olan WARF, MHPF ve YVGWF peptitlerin ADE inhibitör aktivite gösterdikleri in silico olarak tespit edilmiştir. LOPH-F2 için 9 adet ADE inhibitör peptit tanımlanmıştır ve en yüksek PeptideRanker skoru 0,98 olarak GNWF dizisinde elde edilmiştir. PPPH için ise tanımlanan 4 peptit ADE inhibisyonuna sahiptir ve en yüksek PeptideRanker skoru (0,93) NWVCIF dizisinde elde edilmiştir. ADE ile potansiyel olarak ADE inhibitör peptitler arasındaki etkileşimleri araştırmak için, en yüksek PeptideRanker skorlarına sahip peptit dizileri, etkileşimlerin gücünü belirlemek amacıyla Pepsite2 araçları aracılığıyla analiz edilmiştir. Diğer taraftan, URPH-F1, LOPH-F2 ve PPPH'nin in vitro sitotoksisitesi araştırılmıştır. URPH-F1 ve LOPH-F2'nin 125 µg/mL'lik konsantrasyonlarda canlı hücre sayılarını azalttığı ancak daha düşük konsantrasyonlarda toksik etki göstermediği tespit edilmiştir. Ayrıca PPPH'nin uygulanan her 3 konsantrasyon için de (125, 62,5, 31,25 µg/mL) toksik etki göstermediği görülmüştür. Ayrıca uygulanan ToxinPred analizi ile de URPH-F1, LOPH-F2 ve PPPH'nin in silico olarak toksik etki göstermediği tespit edilmiştir. Dördüncü iş paketinde en yüksek ADE inhibitör aktivite gösteren URPH-F1, LOPEF2 ve PPPH ince film hidrasyonu yöntemi ile enkapsüle edilmiştir. Nanolipozomların karakterizasyonu için fiziksel (zeta potansiyeli, polidispersite indeksi, parçacık boyutu), termal (DSC) ve morfolojik özellikler (SEM) ve FT-IR analizleri yapılmıştır. Ayrıca, depolama, pH-ısı uygulamaları ve in vitro gastrointestinal sindirim sonrasında nanolipozomların biyoaktivitelerindeki değişiklikler incelenmiştir. Nanolipozomlar stabilitelerini artırmak amacıyla %0,6'lık kitosan ile kaplanmıştır. Kitosan kaplı makroalgal nanolipozomlar (KKML) için zeta potansiyelleri 37,65 mV (E-PPP), 26,7 mV (E-URP) ve 10,93 mV (E-LOP)'tur. Partikül boyutları ise 323,1 nm (PPPHL), 334,84 nm (E-URP) ve 121,53 nm (E-LOP) olarak tespit edilmiştir. E-URP, E-LOP ve E-PPP'nin enkapsülasyon verimleri sırasıyla %93,3; %90,6; %92,0'dır. Elde edilen partikül boyutu ve zeta potansiyel sonuçları SEM analizi ile de desteklenerek KKML'nin küresel ve pürüzsün yapılara sahip olduğu görülmüştür. E-LOP (115,50 ºC) en yüksek termal dayanıklılığa sahipken, onu E-URP (94,58 ºC) ve E-PPP (69,51 ºC) takip etmiştir. Enkapsüle edilen makroalgal peptitlerin ADE inhibitör aktiviteleri enkapsüle edilmeyenlere göre azalmıştır. KKML'nin depolama stabiliteleri incelendiğinde ilk 7 gün içinde ADE inhibitör aktivitelerinin sıfıra yaklaştığı görülmüştür. KKML'nin pH-ısıl stabiliteleri zeta potansiyelleri, partikül boyutları, ADE inhibitör aktiviteleri ve morfolojik özellikleri incelenerek değerlendilmiştir. pH 6'nın ve 60 ºC'nin üzerindeki uygulamalarda nanolipozomlar stabilitelerini ve biyoaktivitelerini kaybetmiştir. In vitro gastrointestinal sindirim sonrasında E-PPP'nin ADE inhibitör aktivitesini %38,81 oranında koruduğu tespit edilmiştir. E-URP için ADE inhibitör aktivitede artış görülürken E-LOP'un ADE inhibitör aktivitesini tamamen kaybettiği gözlenmiştir. Beşinci iş paketinde 43728 numaralı İTÜ-BAP projesi kapsamında Türkiye'nin Ege kıyılarından toplanan Gracilaria bursa-pastoris'in kimyasal kompozisyonu tanımlanmıştır. Kırmızı makroalgler için değerli olan fikobiliproteinler geleneksel ve sub-kritik su ekstraksiyonu (SKSE) yöntemleri ile elde edilerek, ekstraktlar fikobiliprotein miktarı ve antioksidan aktivite açısından karşılaştırılmıştır. G. bursapastoris %61,35 karbonhidrat, %7,79 protein, %28,40 kül ve %0,23 lipid miktarına sahiptir. SKSE ile elde edilen fikobiliprotein verimi geleneksel yönteme göre daha yüksek bulunmuştur. SKSE ile elde edilen fikobiliportein ekstraktlarının antioksidan aktiviteleri (CUPRAC ve DPPH) de daha yüksektir (p<0,05). SKSE uygulamasında artan sıcaklık artışı ile de antioksidan aktivitenin arttığı tespit edilmiştir.