Yeni Bir Bağırsak Ve Endotelyal Hücre Ko-kültür Modeli İle Sindirim Modellerinin Birlikte Kullanılarak Kara Havucun Biyoyararlılık Ve Biyoaktivitesinin Çalışılması

thumbnail.default.placeholder
Tarih
2016-10-18
Yazarlar
Beştepe, Senem Kamiloğlu
Süreli Yayın başlığı
Süreli Yayın ISSN
Cilt Başlığı
Yayınevi
Fen Bilimleri Enstitüsü
Institute of Science And Technology
Özet
Günümüzde, kökeni Türkiye ve Orta ve Uzak Doğu olan kara havuç antosiyaninler başta olmak üzere içerdiği önemli miktardaki polifenollerden ötürü artan bir ilgi kazanmıştır. Kara havuç genellikle ham olarak tüketilmek yerine başka ürünlere işlenerek veya gıda renklendiricisi olarak değerlendirilmektedir. Kara havucun işlenmesi sonucu oluşan büyük miktarlardaki yan ürünler, genellikle atık olarak ayrılmaktadır veya en iyi ihtimalle hayvan yemi gibi düşük değerli uygulamalarda kullanılmaktadır. Bununla birlikte, kara havucun işlenmesi sonucu ortaya çıkan yan ürünler, fonksiyonel gıdaların geliştirilmesinde kullanılabilecek, nispeten ucuz ama değerli polifenol kaynakları olarak kullanılma potansiyeline sahiptirler. Yukarıdakiler dikkate alınarak kara havuç polifenollerinin biyoyararlılığını ve biyoaktivitesini çalışmak amacıyla bir araştırma çerçevesi oluşturulmuştur. Bu doktora tezinin hedefleri (i) gıda işleme ve depolamanın kara havuç polifenolleri üzerinde etkisini tespit etmek; (ii) çeşitli in vitro mide-bağırsak sindirim ve emilim modellerini kullanarak kara havuç, işlenmiş ürünler ve bunların tarımsal yan ürünlerinde bulunan başlıca polifenollerin biyoerişilebilirliğini ve bağırsak taşınımını araştırmak; (iii) gıda ürünlerinin zenginleştirilmesi vasıtasıyla kara havucun yan ürünlerini değerlendirmek ve (iv) emilim etkilerini endotelyal hücre metabolizmasındaki değişiklikler ile birleştiren bir in vitro model geliştirmektir. Yukarıdaki hedeflere ulaşmak için dört farklı deneysel çalışma (Bölüm 3–6) yapılmıştır. Öncelikle kara havuç reçel ve marmelata işlenmiş, karanlıkta depolanmış ve polifenol içeriğinde meydana gelen değişimler izlenmiştir (Bölüm 3). Daha sonra, kara havuç, reçel ve marmelat, ve kara havucun yan ürünleri (kabuk ve posa), in vitro mide-bağırsak sindirimine tabi tutulmuştur (Bölüm 3 ve 4). Bunu takiben kara havuç posası keki zenginleştirmek için polifenol kaynağı olarak kullanılmıştır (Bölüm 5). Son olarak, kara havuç ve yan ürünlerdeki polifenollerin endotelyal hücrelerdeki anti-inflamatuar etkilerini tespit etmek amacıyla bir in vitro bağırsak ve endotelyal hücre ko-kültür modeli geliştirilmiştir (Bölüm 6). İlk bölümde bu doktora tezinin araştırma çerçevesi ve hedefleri tanıtılmıştır. Bunu takiben ikinci bölümde kara havuç polifenollerinin biyoyararlılığı ve biyoaktivitesi ile ilgili kapsamlı bir derleme sunulmuştur. Başlangıç olarak kara havuç polifenolleri (antosiyaninler ve fenolik asitler) ve bunlarla ilgili sağlık etkilerinden bahsedilmiştir. Sonrasında gıda işleme ve depolamanın kara havuç polifenolleri üzerine etkilerini araştıran çalışmalar derlenmiştir. Daha sonra, biyoyararlılığı etkileyen faktörler, ve kara havuç polifenolleri ve diğer polifenollerin biyoyararlılığını ölçmek için kullanılan yöntemler ele alınmıştır. Son olarak, polifenollerin endotelyum üzerindeki etkileri ve polifenol araştırmaları için kullanılan hücre kültürü modellerindeki eğilimler ve potansiyel uygulamalardan bahsedilmiştir. Üçüncü bölümde reçel ve marmelata işlemenin, depolama koşullarının ve in vitro mide-bağırsak sindiriminin kara havucun toplam ve bireysel polifenol içeriği ve toplam antioksidan kapasitesine olan etkileri incelenmiştir. Kara havuç reçel ve marmelatları geleneksel yöntemlerle şeker veya tatlandırıcı kullanılarak hazırlanmış ve karanlık ortamda iki farklı sıcakta (4 °C and 25 °C) 20 hafta süresince muhafaza edilmiştir. Toplam polifenol içeriği ve toplam antioksidan kapasite spektrofotometrik yöntemler kullanılarak, bireysel polifenoller ise HPLC–PDA kullanılarak tespit edilmiştir. Bu bölüm ve de diğer tüm deneysel bölümlerde (Bölüm 3–6) kullanılan kara havuç örneklerinde tespit edilen ana antosiyaninlerin hepsi siyanidin bazlı olup farklı şekerlere bağlanmışlardır. İçlerinden iki tanesi açillenmemiş (siyanidin-3-ksilosil-glükosil-galaktozid ve siyanidin-3 ksilosil-galaktozid), üç tanesi ise sinapik asit (siyanidin-3-ksilosil-sinapol-glükosil-galaktozid), ferulik asit (siyanidin-3-ksilosil-feruyol-glükosil-galaktozid) ve kumarik asit (siyanidin-3-ksilosil-kumarol-glükosil-galaktozid) ile açillenmiştir. Elde edilen sonuçlar kara havucun reçel ve marmelata işlenmesi sonucunda polifenol içeriğinde istatistiksel olarak önemli düşüşler olmasına rağmen (%49.5–96.7) (p < 0.05) sindirimden sonra işlenmiş ürünlerdeki polifenollerin hammaddeye kıyasla daha biyoerişilebilir olduğunu göstermiştir (%0.8–31.5). Ek olarak, 20 hafta depolama süresi sonucunda 25 °C’de depolanan örneklerin polifenol içeriğindeki azalmanın (%26.4–92.2) 4 °C’de depolanan ürünlerden (%19.0–46.4) daha yüksek olduğu görülmüştür. Sonuç olarak, bu bölümde sunulan deneysel çalışma sonuçları kara havuç reçel ve marmelatındaki polifenolerin depolama ve sindirim neticesinde belli bir dereceye kadar korunduğunu ve bu ürünlerin tüketimi ile dikkate değer bir miktarda polifenol alınımı sağlanabileceğini, ve dolayısıyla bu ürünlerin yeni bir fonksiyonel gıda kaynağı olabilecekleri göstermiştir. Bu bölümde uygulanan HPLC yöntemi, bu bölümü takip eden diğer bölümlerde de kullanılmıştır (Bölüm 4–6). Kara havuç dahil olmak üzere bitkisel kökenli birçok gıdanın işlenmesi büyük miktarlarda yan ürünlerin oluşmasına neden olmaktadır. Oluşan bu yan ürünler gıda sanayisi için önemli bir bertaraf sorunu oluşturmakla beraber aynı zamanda biyolojik olarak aktif olan birçok bileşiği de içermektedirler. Bu durum dikkate alınarak bu tezin dördüncü bölümünde kara havuç ve kara havucun yan ürünlerinde (kabuk ve posa) bulunan polifenollerde in vitro mide-bağırsak sindirimi sırasında meydana gelen değişiklikler üzerinde durulmuştur. Bu bölümde uygulanan sindirim modeli sırasıyla mide, ince bağırsak ve kalın bağırsaktaki sindirimi taklit eden üç aşamalı bir prosedürden oluşmaktadır. Elde edilen sonuçlar sindirim sonucunda polifenol miktarlarında istatistiksel olarak önemli azalmalar (%23−82) (p < 0.05) olmasına rağmen posada bulunan antosiyaninlerin in vitro mide-bağırsak sindiriminin tüm aşamaları boyunca kara havuç antosiyaninlerinden daha biyoerişilebilir olduğunu göstermiştir. Sonuç olarak bu bölümde sunulan deneysel çalışma sonuçlarıyla beraber kara havucun yan ürünlerinin önemli polifenol kaynakları olabilecekleri ve diğer gıda ürünlerini zenginleştirmek için kullanılabilecekleri vurgulanmıştır. Bu bölümde uygulanan in vitro mide-bağırsak sindirim modeli daha sonra altıncı bölümde de kullanılmıştır. Dördüncü bölümdeki bulgular da dikkate alınarak, beşinci bölümde kara havuç posası kek örneklerini zenginleştirmek için kullanılmıştır. Kara havuç posası ile zenginleştirilmiş keklerdeki polifenollerin sindirim sırasındaki stabiliteleri incelenmiş ve toplam antioksidan kapasitelerinde meydana gelen değişiklikler yeni standardize edilmiş bir in vitro sindirim modeli kullanılarak takip edilmiştir. Sonuçlar sindirilmemiş örnekler için keklerin %5, %10 ve %15 oranlarında kara havuç posası ile zenginleştirilmesinin antosiyanin içeriği (72−267 μg/g kuru ağırlık), fenolik asit içeriği (49−148 μg/g kuru ağırlık), toplam fenolik madde içeriği (54−202 mg GAE/100 g kuru ağırlık) ve antioksidan kapasitede (21−478 mg TE/100 g kuru ağırlık) eklenen dozla doğru orantılı bir artışa neden olduğunu göstermiştir. Ağız ve midedeki in vitro sindirim sırasında polifenol miktarında istatistiksel olarak önemli miktarda azalmalar (%35−74) (p < 0.05) meydana gelmiştir. Bağırsak sindiriminden sonra ise hiçbir antosiyanin tespit edilememiştir. Diğer bir yandan mide ve bağırsakta toplam fenolik madde ve toplam antioksidan kapasite içeriklerinde önemli miktarda artışlar meydana gelmiştir (sırasıyla 5− ve 12−kat) (p < 0.05). Sonuç olarak, bu bölümde sunulan deneysel çalışma sonuçları fonksiyonel bir bileşen olan kara havuç posasının fırıncılık sanayisinde kullanılabileceğini göstermiştir. Altıncı bölümde kara havuç ve kara havucun yan ürünlerinde bulunan polifenollerinin bağırsak hücreleri ile ko-kültürlenmiş ve tümör nekroz faktörü α (TNF-α) ile uyarılmış endotelyal hücrelerindeki inflamatuar tepkiyi etkileme potansiyali tespit edilmiştir. Polifenollerin biyoaktivitelerini göstermeleri biyoyararlılıklarına bağlı olduklarından dolayı, polifenollerin anti-inflamatuar etkilerinin değerlendirilmesinde mide-bağırsak sindirimi ve bağırsaktan geçişi de dikkate alınmıştır. Elde edilen sonuçlar uygulamadan 4 saat sonra sindirilmiş örneklerdeki polifenol geçişinin (%1.3−7) sindirilmemiş örneklere kıyasla (%0−3.3) daha yüksek olduğunu göstermiştir. Bağırsaktan geçen polifenoller hem normal hem de TNF-α ile uyarılmış edilmiş koşullarda proinflamatuar markörlerin (interlökin-8 (IL-8), monosit kemoatraktant protein-1 (MCP-1), vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) ve interselüler adhezyon molekülü-1 (ICAM-1)) salgılanmasını düzenleyebilmişlerdir. En belirgin etkiler, inflamatuar koşullar altında sindirilmiş örneklerde gözlenmiştir. Tüm markörlerin salgılanması %120−203’den %34−144%’de düşmüştür (p < 0.001). Sonuç olarak bu bölümde sunulan deneysel çalışma sonuçları kara havuç ve kara havucun yan ürünlerinde bulunan polifenollerin endotelyal hücrelerdeki inflamasyonda inhibitör olarak işlev görebileceğini göstermiştir. Bu durum batı tipi diyetle beraber önceden var olan düşük dereceli inflamasyona karşı sürdürülebilir bir kardiyovasküler etkinin oluşmasını sağlanabileceğini göstermektedir. Son olarak, yedinci bölümde, önceki bölümlerde elde edilen veriler dikkate alınarak polifenollerin biyoyararlılığı ve biyoaktivitesi ile ilgili genel bir tartışma, sonuçlar ve gelecekteki araştırmalar için tavsiyeler verilmiştir. Bu tezden elde edilen sonuçlar kara havuç polifenollerinin karakterizasyonu, gıda işleme ve depolamanın kara havuç polifenolleri üzerine etkisi, polifenol kaynağı olarak kara havucun yan ürünleri, kara havuç polifenollerinin biyoulaşılabilirliği, kara havuç polifenollerinin bağırsaktan geçişi ve kara havuç polifenollerinin biyoaktivitesi başlıkları altında ele alınmıştır. Kara havuç polifenollerinin biyoulaşılabilirliği tartışılırken farklı in vitro mide-bağırsak sindirimi modellerinin karşılaştırılması ve gıda işleme ve diğer gıda bileşenlerinin etkisi konularına değinilmiştir. Benzer şekilde, kara havuç polifenollerinin biyoaktivitesi tartışılırken de farklı antioksidan kapasite ölçüm metotları karşılaştırılmış ve polifenollerin anti-inflamatuar etkilerini çalışmak için kullanılan ko-kültür modellerinden bahsedilmiştir.
Nowadays, black carrots, originating from Turkey and the Middle and Far East, have gained increasing interest due to their substantial content of polyphenols, especially anthocyanins. Black carrots are often not consumed as such, instead they are either processed into other products or used as food colorants. Processing of black carrots generates large amounts of by-products, which are often discarded as waste or, in the best case valorized in low-value applications such as animal feed. However, the plant processing by-products of black carrots have the potential to be used as relatively cheap but valuable resources of polyphenols, which could be used in the development of functional foods. Considering the above, a research framework to study the bioavailability and bioactivity of black carrot polyphenols from various sources has been developed. The objectives of this Ph.D. thesis were (i) to determine the effect of food processing and storage on black carrot polyphenols; (ii) to investigate the bioaccessibility and intestinal transport of key polyphenols in black carrots, processed products and their agronomic by-products using various in vitro gastrointestinal digestion and absorption models; (iii) to valorize the by-products from black carrot via enrichment of food products; (iv) to develop an in vitro model that is able to combine absorption effects with changes in endothelial cell metabolism. To achieve these goals, four different experiments (Chapters 3-6) were conducted. Firstly, black carrots were processed into jams and marmalades and stored in the dark and the changes in polyphenol content were monitored (Chapter 3). Then, black carrots, jams and marmalades, as well as plant processing by-products of black carrot, i.e., peel and pomace, were subjected to in vitro gastrointestinal digestion (Chapters 3, 4). Following that, black carrot pomace was used as a source of polyphenols to enrich cakes (Chapter 5). Finally, an in vitro co-culture of intestinal and endothelial cell model was developed to determine the ability of polyphenols from black carrots and by-products to modulate the inflammatory response in endothelial cells (Chapter 6). In Chapter 1, research framework and objectives of this Ph.D. thesis are introduced. Following that, in Chapter 2, a comprehensive review on the bioavailability and bioactivity of polyphenols is presented, with a specific focus on black carrot polyphenols. Initially, black carrot polyphenols, i.e., anthocyanins and phenolic acids, and their related health effects have been introduced. Then, the studies investigating the effect of food processing and storage on black carrot polyphenols have been reviewed. Afterwards, factors affecting the bioavailability and the methods used to assess the bioavailability of polyphenols were discussed with an emphasis on black carrot polyphenols. Lastly, the impact of polyphenols on endothelium and the trends and potential applications of cell culture models for polyphenol research were described. In Chapter 3, the effects of food processing, i.e., jam and marmalade processing, storage conditions and in vitro gastrointestinal digestion on total and individual polyphenol contents and total antioxidant capacity of black carrots were examined. Black carrot jams and marmalades were prepared traditionally using either sugar or sweetener and stored in the dark at two different temperatures (4 °C and 25 °C) over a period of 20 weeks. Total polyphenol contents and total antioxidant capacity were determined using spectrophotometric methods, whereas individual polyphenols were quantified using HPLC–PDA. The major anthocyanins detected in black carrots used in all experimental chapters (Chapter 3–6) were cyanidin-based with different sugar moieties, among them two were non-acylated (cyanidin-3-xylosyl-glucosyl-galactoside and cyanidin-3-xylosyl-galactoside), and three were acylated with sinapic acid (cyanidin-3-xylosyl-sinapoyl-glucosyl-galactoside), ferulic acid (cyanidin-3-xylosyl-feruloyl-glucosyl-galactoside) and coumaric acid (cyanidin-3-xylosyl-coumaroyl-glucosyl-galactoside). The results showed that although processing of black carrots into jams and marmalades resulted in significant decreases in polyphenol content and total antioxidant capacity (49.5–96.7%) (p < 0.05), after digestion polyphenols from processed products were found to be more bioaccessible compared to the ones in raw material (0.8–31.5%). In addition, after 20 weeks of storage the reduction in polyphenol content of samples stored at 25 °C (26.4–92.2%) was higher than samples stored 4 °C (19.0–46.4%). In conclusion, this chapter showed that black carrot jams and marmalades provide considerable polyphenol intake, which are preserved to a certain degree after storage and digestion, and hence these products can serve as novel sources of functional foods. The HPLC method applied in this chapter was used in the succeeding chapters (Chapters 4-6). Processing of foods of plant origin including black carrot generates large amounts of by-products. These by-products represent a major disposal problem for the industry concerned; however, they are also promising sources of bioactive compounds. Considering that, in Chapter 4, we focused on the changes in polyphenols and total antioxidant capacity from black carrot and its by-products, i.e., peel and pomace, during in vitro gastrointestinal digestion, which consisted of a three-step procedure simulating the digestion in the stomach, small intestine, and colon. The results showed that although the amount of polyphenols decreased significantly as a result of digestion (23−82%) (p < 0.05), the pomace anthocyanins released at all stages of in vitro gastrointestinal digestion were higher than black carrot anthocyanins, suggesting that pomace may be a better source of bioaccessible anthocyanins. Overall, this chapter highlighted black carrot by-products as substantial sources of polyphenols, which may be used to enrich food products. In vitro digestion method developed in this chapter is used later in Chapter 6. Taking into account the findings of Chapter 4, in Chapter 5, black carrot pomace was used to enrich cake samples. We investigated the digestive stability of polyphenols from black carrot pomace enriched cakes and monitored changes in their total antioxidant capacity using a new standardized static in vitro digestion model. Results showed that for undigested samples enrichment of cakes with black carrot pomace at levels of 5%, 10% and 15% caused a dose-dependent increase in anthocyanins (72 to 267 μg/g dw), phenolic acids (49 to 148 μg/g dw), total phenolics (54 to 202 mg GAE/100 g dw) and total antioxidant capacity (21−129 to 153−478 mg TE/100 g dw). During the in vitro digestion in the mouth and stomach the amount of polyphenols were reduced significantly (35−74%) (p < 0.05), whereas no anthocyanins were detected in the intestine after intestinal digestion. On the other hand, significant increases in total phenolics and total antioxidant capacity were obtained in the stomach and intestine (up to 5− and 12−fold respectively) (p < 0.05). Overall, this chapter demonstrated that black carrot pomace, which can serve as a functional ingredient might be utilized in the baking industry. In Chapter 6, we determined the potential of polyphenols from black carrot and its by-products to modulate the inflammatory response in tumor necrosis factor α (TNF-α) stimulated endothelial cells co-cultured with differentiated intestinal cells. As the bioactivity of polyphenols depends on their bioavailability, gastrointestinal digestion as well as transepithelial intestinal absorption was also considered while evaluating the anti-inflammatory effects of polyphenols. The results indicated that after 4 h of treatment, the transport of polyphenols was higher for digested samples (1.3−7%) compared to undigested ones (0−3.3%). The transported polyphenols were able to regulate the secretion of pro-inflammatory markers, i.e., interleukin-8 (IL-8), monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), vascular endothelial growth factor (VEGF) and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), under normal and TNF-α induced inflammatory conditions. The most pronounced effects were observed with digested samples under inflammatory conditions, which significantly decreased the secretion of all markers from 120−203% down to 34−144% (p < 0.001). Eventually, the results of this chapter suggest that polyphenols from black carrot and its by-products may function through an inhibitory regulation of the inflammatory cascade in endothelial cells, which can maintain a sustainable cardiovascular effect under pre-existing low-grade inflammation caused by Western-type diets. Finally, in Chapter 7, based on the outcomes of the previous chapters, the general discussions and conclusion, as well as the future perspectives on the bioavailability and bioactivity of polyphenols is presented. The status and main outcomes of this thesis were discussed under the headings of characterization of black carrot polyphenols, impact of food processing and storage on black carrot polyphenols, black carrot by-products as sources of polyphenols, bioaccessibility of black carrot polyphenols, intestinal transport of black carrot polyphenols and bioactivity of black carrot polyphenols. During the discussion on the bioaccessibility of black carrot polyphenols, special attention has been paid to comparison of different in vitro gastrointestional digestion models and the effects of processing and other dietary compounds. Similarly, while referring to the bioactivity of black carrot polyphenols, different antioxidant capacity assays were compared and co-culture models to study anti-inflammatory effects of polyphenols were discussed.
Açıklama
Tez (Doktora) -- İstanbul Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, 2016
Thesis (PhD) -- İstanbul Technical University, Institute of Science and Technology, 2016
Anahtar kelimeler
antioksidan kapasite; antosiyaninler; biyoulaşılabilirlik; Caco-2; Daucus carota L.; EA.hy926; fenolik asitler; gıda işleme; HPLC; in vitro gastrointestinal sindirim; kabuk; kara havuç; kısa zincirli yağ asitleri; marmelat; polifenoller; posa; pro-inflammatuar markörler; reçel; transepitelyal taşınım; yan ürünler, anthocyanins; antioxidant capacity; bioaccessibility; black carrot; by-product; Caco-2; Daucus carota L.; EA.hy926; food processing; HPLC; in vitro gastrointestinal digestion; jam; marmalade; peel; phenolic acids; polyphenols; pomace; pro-inflammatory markers; short-chain fatty acids; transepithelial transport
Alıntı