Pyrococcus Horıkoshıı Putatif Glutamat Sentaz Küçük Altünite Homologlarının Heterelog Expresyonu

Abstract

Glutamat sentaz (GOGAT), bakteri, alg ve bitkilerde amonyak asimilasyonun ilk basamaklarında görev alan ve glutaminin amido azotunun 2-okzoglutarata transamidasyonu sonucu iki molekül glutamat oluşumunu katalizleyen önemli bir enzimdir. GOGAT tarafından kullanılan amonyak, bitkilerde fotorespirasyon, amino acid yıkımı gibi metabolik işlemler sonucu sağlanabildiği gibi, nitrat ve atmosferik diazot gibi dış azot kaynaklarının indirgenmesi yoluyla da sağlanabilir. Pyrococcus cinsinden olan P. horikoshii, P. furiosus ve P. abyssi’nin genomlarında, glutamat sentazın küçük altünitesine benzerlik gösteren iki tane homolog bölge vardır. Bununla beraber P. horikoshii ve P. abysii’nin genomlarında, enzimin glutamat oluşumundan sorumlu olan büyük altünitesini kodlayan bir bölge bulunmamaktadır. İki tane putatif glutamat sentaz küçük altünite homoloğunun varlığı, gen duplikasyonu olasılığını düşündürmektedir. Glutamat sentazın evriminin, lateral gen transferi ve iki altünitenin yüksek yapılı canlılarda birleşmesi olaylarını kapsaması muhtemeldir. Bunlar ışığında, bu homolog bölgelerin, elektron transfer protein domeynlerinin arkealarda bulunan erken formları olabilecekleri ve daha sonradan evrim sürecinde elektron transfer enzimlerin yapısına katılmış olabilecekleri düşünülebilir. Bu çalışmada, bu hipotezin gerçekliğini araştırmak için, Pyrococcus horikoshii’ nin iki putatif glutamat sentaz küçük altünitesi homoloğu, PH0876 ve PH1873, klonlanmış ve Escherichia coli’de protein ekpresyonu gerçekleştirilmiştir. Elde edilen sonuç Western Blot analizi ile desteklenmiştir. Üretilen proteinler, HisTag füzyon proteini olmalarından faydalanılarak saflaştırılmıştır. Buna ek olarak, aktivite analizlerinde kontrol amaçlı kullanılacak olan Medicago sativa’ya ait NADH-bağımlı glumat sentazın, küçük altünite ile benzerlik gösteren bölgesi de ekpresyon vektörüne klonlanmış ve Escherichia coli’de protein ekpresyonu gerçekleştirilmiştir.

Glutamate synthase (often abbreviated as GOGAT) is a key enzyme in the early stages of ammonia assimilation in bacteria, algae and plants, catalyzing the reductive transamidation of the amido nitrogen from glutamine to 2-oxoglutarate to form two molecules of glutamate. The ammonia that enters this pathway can be supplied either by internal metabolic processes, such as photorespiration in plants as well as amino acid catabolism, or through the reduction of external nitrogen sources, such as nitrate and atmospheric dinitrogen. The genomes of three Pyrococcus species, P. horikoshii, P. furiosus and P. abyssi, harbour two open reading frames which show homology with the small subunit of glutumate synthase ( subunit of GOGAT). There are no open reading frames which may be coding for a large subunit responsible for the glutamate formation in the genomes of P. horikoshii and P. abysii. The presence of two putative GOGAT small subunits raises the possibility of gene duplication. Evolution of glutamate synthase might have occurred via lateral gene transfer via the combination of two subunits in the higher organisms. It seems likely that these open reading frames are the early forms of an electron transfer domain in archaea which may have later contributed to many electron transfer enzymes. To further analyze this hypothesis, two open reading frames PH0876 and PH1873, from P. horikoshii, have been cloned and successfully expressed in E. coli and the presence of the proteins have been confirmed with Western Blot analysis. In addition, these two proteins have been obtained in the soluble fraction of the cell and purified with the aid of His-Tag present upstream the coding region. The  subunit-like C terminal region of NADH-dependent glutamate synthase from Medicago sativa has also been cloned, expressed in E. coli to be used as a control in activity analysis.