Aterosklerozda Mirna-126 Sinyal Yolağı Molekülleri İle İlişkili Anjiyogenik Mekanizmaların Araştırılması

Abstract

Kardiyovasküler hastalıklar, kalp ve kalp damarlarının, beyin damarlarının ve vücuttaki tüm di ˘ ger damarların hastalıkları olarak tanımlanırlar. Ateroskleroza baglı olarak ortaya çıkan kardiyovasküler hastalıklar arasında, koroner arter hastalıkları, serebro-vasküler hastalıklar, periferal arter hastalıgı ve hipertansif kalp hastalıgı bulunmaktadır. Dünya Saglık Örgütü tarafından 2014 yılında yayınlanan Kalp ve Damar Hastalıklarını Önleme ve Kontrolü Küresel Atlası verilerine göre, dünyada 2012 yılında gerçeklesmis olan 56 milyon ölümün 38 milyonu kardiyovasküler hastalıklar, kanser, kronik solunum yolu hastalıkları ve diyabet gibi bula¸sıcı olmayan hastalıklar nedeniyle meydana gelmistir. 2012 yılında kardiyovasküler hastalıklar nedenli ölümler, tüm dünyada birincil ölüm nedeni olup, tüm ölümlerin % 31'ini olu¸sturmustur. Tüm kardiyovasküler hastalıklar ile iliskili ölümlerin 7.4 milyonu koroner arter hastalıgına baglı olarak, 6.7 milyonu ise inme nedenli gerçeklesmistir. Türkiye Istatistik Kurumu tarafından yayınlanan Ölüm Nedeni Istatistikleri 2014 verilerine göre, kardiyovasküler hastalık kaynaklı ölümler, 2014 yılında gerçeklesmis olan tüm ölümlerin %40.4'ünü olusturarak, birincil ölüm sebebini teskil etmistir. Günümüzde hala tüm dünyadaki bir numaralı ölüm nedeni olan kalp ve damar hastalıklarının altında yatan temel mekanizma aterosklerozdur. Ateroskleroz dogumla baslayan geri dönüssüz bir süreç olsa da, ana risk faktörleri göz önüne alındıgında, aterosklerozun yol açtıgı kardiyovasküler hastalıklar büyük ölçüde önlenebilmektedir. Kalp ve damar hastalıgı risk faktörlerinin bazıları degistirilememektedir, ancak büyük çogunlugu kontrol edilebilmekte, tedavi edilebilmekte veya modifiye edilebilmektedir. Degistirilemeyen veya kontrol edilemeyen risk faktörlerinin basında ileri yas, erkek cinsiyet ve genetik etmenler gelmektedir. Öte yandan, yüksek kolesterol seviyeleri, hipertansiyon, obezite, diyabet, sigara kullanımı ve fiziksel inaktivite gibi risk faktörleri tedavi edilebilir ve modifiye edilebilir risk faktörleri olarak degerlendirilmektedir. Bu tez çalısmasında, karotis arter hastalarından elde edilmis olan aterosklerotik plak örnekleri kullanılmıstır. Ateroskleroza baglı ortaya çıkan arter hastalıgı, beyine kan götüren damarlar olan karotis arterlerdeki kan akısının tıkanıklıga baglı azalması sonucu meydana gelir. Beyindeki belirli bir bölgeye, karotis arterlerdeki tıkanıklıga baglı olarak kan akısı azaldıgında, o bölgede fonksiyon kaybı ve buna baglı olarak geçici iskemik atak olarak isimlendirilen semptomlar ortaya çıkar. Görme kaybı (Amaurosis fugax), konusmada bozukluklar, ekstremitelerde güçsüzlük hissi ve yüzde duyu kaybı bu semptomlardan bazılarını olusturmaktadır. Beyindeki bir bölgeye kan akısı aniden kesildiginde ise inme olarak adlandırılan durum meydana gelir. Karotis arter hastalıgının teshisi için, ultrason ve manyetik rezonans anjiyogram gibi görüntüleme tekniklerinden yararlanılmaktadır. Bu testler sayesinde, karotis arterlerde meydana gelen daralmanın, bir diger deyisle, stenozun varlıgı ve derecesi belirlenebilir. Asemptomatik ve semptomatik karotis arter hastalıgının ayrımı önem tasımaktadır. Asemptomatik hastalıkta, geçici iskemik ataklar veya inme olmaksızın, proksimal internal karotis arterde % 50–60 stenoz gözlemlenir. Asemptomatik hastalıgın ilerleyisini önlemek amacıyla, hipertansiyon, diyabet ve yüksek kolesterol gibi risk faktörlerinin tedavisi gibi invazif olmayan terapiler uygulanmaktadır. Ileri derecede stenozun (≥ %60) tedavisi için ise, karotis endarterektomisi ve karotis arterlere stent yerle¸stirilmesi gibi invazif terapiler tercih edilmektedir. Karotis endarterektomi operasyonu semptomatik hastalarda gelecek inme riskinin azaltılması amacıyla gerçeklestirilir. Bu cerrahi operasyon ile karotis arterlerde daralmaya neden olan aterosklerotik plaklar çıkartılır. Bu çalısmada, karotis arterlerinde %70'den daha yüksek derecede veya %50 ile %70 arasında degisen darlık bulunan 14 adet semptomatik hastadan endarterektomi esnasında çıkartılan aterosklerotik plaklar ve plak etrafındaki bölgeden elde edilen kontrol dokuları kullanılmıstır. Ateroskleroz, orta ve büyük çaplı arterlerin kronik, dejeneratif, immun-enflamatuvar hastalıgıdır. Pek çok genetik etmen ve çevresel etmenin etkilesimini içeren kompleks bir hastalık olarak tanımlanır. Dogum ile baslayan aterosklerotik süreç, yavas ilerleyerek, özellikle 40 ve 50 yas sonrasında koroner arter hastalıgı, inme ve periferal arter hastalıgı gibi rahatsızlıklara neden olur. Ateroskleroz enflamasyonun çok etkin oldugu bir süreç olup, arterlerin en iç tabakası olan intima tabakasının kalınlasması sonucu olusan lipid bakımından zengin materyal (aterom) ve konnektif doku (skleroz) ile karakterizedir. Aterosklerotik süreci açıklamaya yönelik gelistirilmis olan hipotezler arasında bulunan ve yaygın kabul gören "Hasara tepki" hipotezine göre, hiperlipidemi, hipertansiyon, çesitli metabolitler, enfeksiyonlar ve mekanik faktörler gibi potansiyel kaynaklar endotel hasarına sebep olarak aterosklerotik süreci baslatırlar. Ateroskleroz patogenezinde yer alan temel basamaklar, endotel disfonksiyonu, LDL kolesterolün oksidasyonu, monositlerin damar duvarına yapısması ve damar duvarından içeriye girisleri, monositlerin makrofajlara farklılasması ve makrofajların okside-LDL partiküllerini fagosite etmeleri sonucu köpük hücre olusumu, düz kas hücrelerinin intima tabakasına göç etmeleri ve proliferasyonları sonucu fibröz baslık olusumu, ilerlemis lezyonlardaki makrofajların apoptozuna baglı olarak plak nekrotik çekirdeginin olusumu, plak içerisinde neoanjiyogenez ve plagın yırtılması ile trombüs olu¸sumu olarak sıralanabilir. Kararsız plakların yırtılması sonucunda olu¸san trombüs, inme ve miyokard enfarktüsü gibi durumlara ve bu durumlara baglı olan sakatlıklara ve ölümlere yol açmaktadır. Trombüs olu¸sumu engellenebilir oldugu taktirde aterosklerozun çok daha iyi huylu seyreden bir hastalık olacagı pek çok çalısmada önerilmektedir. Ilerlemis aterosklerotik plakların içerisindeki yeni damar olusumuna yol açan moleküler mekanizmaların ara¸stırılması, bu tez çalısmasının odak noktasını olusturmaktadır. Anjiyogenez, var olan damarlardan yeni damar olusumudur. Hücrelerde anjiyogenezi kontrol eden temel sinyal yolakları vasküler endoteliyal büyüme faktörü yolagı ve Notch sinyal yolagıdır. Aterosklerotik plak içi anjiyogenezin aterosklerozun ilerleyisi ile olan iliskisi pek çok çalısma ile gösterilmistir. Bu nedenle, anjiyogenezle iliskili olan sinyal yolakları, plak içi anjiyogenezi önlemeyi amaçlayan terapiler için hedef teskil etmektedirler. Bu tez çalısması, vasküler endoteliyal büyüme faktörü yolagı ile iliskili anjiyogenik mekanizmaların rolünün ve mikroRNAlar gibi, bu yolak ile etkilesimde bulunan moleküllerin arastırılmasını amaçlamaktadır. MikroRNAlar (miRNAlar) küçük, tek-iplikçikli RNA molekülleridir. Genellikle 18-22 nukleotid uzunlugunda olan ve kodlama yapmayan bu RNAlar, gen anlatımını transkripsiyon sonrası seviyede düzenleyen önemli regülatör moleküller olarak görev yaparlar. MiRNAlar pek çok önemli biyolojik fonksiyon ve hücresel olayda görev alırlar. MiRNAların görev yaptıkları önemli hücresel prosesler arasında hücre proliferasyonu, metabolizma, apoptoz, senesens, tümör olusumu, damar olusumu ve gelisim gelmektedir. Anjiyogenezde çok önemli rolü olan ve hem embriyonik hem de yetiskin damar sisteminde anlatımı yapılan Egfl7, endotele spesifik iki adet mikroRNA olan miR 126-3p ve miR 126-5p'yi intronundan kodlar. MiR-126 sinyal yolagının anjiyogenezdeki rolünü ve ateroskleroz patogenezine katkısını ortaya çıkarmak amacı ile gerçeklestirilen bu çalısmada, miR 126-3p ve hedef genleri ile miR 126-5p ve Egfl7'nin ekspresyon seviyeleri 14 adet karotis arter aterosklerotik plak dokusu ve 14 adet kontrol dokusunda incelenmistir. Mir 126-3p hedef genleri miRNA hedef tahmin veritabanları olan TargetScan and miRTarBase kullanılarak elde edilmis, elde edilen bilgiler ve literatür arastırması sonucunda anjiyogenezde rolü olan ve vasküler endoteliyal büyüme faktörü sinyal yolagının negatif regülatörleri olan Spred1 and Pik3r2 genleri ile Egfl7'nin çalısılacak miR 126-3p hedef genleri olarak seçilmesine karar verilmistir. Ön biyoinformatik arastırmayı takiben, 14 adet karotis arter aterosklerotik plak ve kontrol dokusunun homojenizasyonu ve sonrasında elde edilen homojenizatlardan total RNA ve miRNA izolasyonları gerçeklestirilmistir. RNA izolasyonları sonucunda elde edilen total RNA ve miRNA'ların konsantrasyonları ve saflıkları spektrofotometrik yöntemle belirlenmis, ve RNA miktarları esitlenerek komplementer DNA (cDNA) reaksiyonları gerçeklestirilmistir. Elde edilen cDNA'lar kullanılarak gerçek zamanlı kantitatif PZR reaksiyonları yürütülmüs ve bu sayede plak ve kontrol dokularındaki Egfl7, Spred1, Pik3r2, miR 126-3p ve miR 126-5p rölatif ekspresyon seviyeleri ölçülmüstür. Gerçek zamanlı kantitatif PZR analizleri için, 2∆∆CT modelinin kullanıldıgı rölatif kantifikasyon stratejisinden yararlanılmıstır. Plak örneklerindeki tüm hedef gen ve miRNA ekspresyon seviyeleri kontrol örneklerindeki hedef gen ve miRNA seviyeleri ile karsılastırılmıs ve 18S ribozomal RNA (hedef genler için) ve U6 küçük nüklear RNA (miRNAlar için) endojen kontrolleri kullanılarak normalizasyon yapılmıstır. Data analizlerini takiben, istatistiksel analizler gerçekle¸stirilmistir. Plak ve kontrol dokularından elde edilen sonuçlar arasındaki farkın istatistiksel anlamlılıgı Student's t test ile arastırılmıstır. Kat farkı olarak ifade edilen gen ekspresyon verileri, hastaların demografik ve klinik bilgileri ile karsılastırılmıstır. Bu analizler için Chi-square ve Fisher's Exact testleri kullanılmıstır. Bu çalısmada, literatürden elde edilen bilgiler derlenerek, ilerlemis aterosklerotik hastalıga baglı olarak görülen anjiyogenez nedeni ile, Egfl7 ve miR 126-3p ile miR 126-5p'nin karotis arter aterosklerotik plaklarında, kontrollere göre up-regüle olacagı, buna karsılık miR 126-3p hedef genleri olan Spred1 ve Pik3r2'nin ekspresyon seviyelerinin plaklarda kontrollere göre azalmıs olacagı hipotezi ortaya konulmustur. Sonuçlara bakıldıgında, beklendigi üzere miR 126-3p ekspresyon seviyelerinin 11 adet plak örneginde, kontrollere göre yüksek oldugu bulunmus, miR 126-3p hedef genleri olan Spred ve Pik3r2'nin ekspresyon seviyelerinin kontrollere göre 8 ve 9 adet plak örneginde daha düsük oldugu gözlemlenmistir. Genel ekspresyon seviyesi göz önüne alındıgında, miR 126-3p'nin plaklardaki ekspresyonunun, kontrollere göre 2.14 kat arttıgı bulunmustur (p

THE INVESTIGATION OF ANGIOGENIC MECHANISMS ASSOCIATED WITH miRNA-126 SIGNALLING PATHWAY MOLECULES IN ATHEROSCLEROSIS