Effects of novel food processing techniques on bioaccessibility and transepithelial transport of cranberrybush polyphenols

Abstract

Phenolic compounds, which are present in a wide variety of foods such as fruits, vegetables, flowers and leaf of plants, exhibit a variety of beneficial effects including antimicrobial, antioxidant, antidiabetic, diuretic, hypoglycemic, cough reliever, antiinflammatory and antiviral activities as well as prevention of cardiovascular, pancreas, liver and kidney diseases. However, most of the polyphenols have poor water solubility, chemical instability in gastrointestinal tract and, thus, a reduced bioavailability. Therefore, a wide variety of attempts have been investigated to improve the solubility, stability, bioaccessibility and bioavailability of phenolic compounds. Considering the above, a research framework to study the effects of novel processing techniques on the antioxidant capacity, bioaccessibility and bioavailability of cranberrybush polyphenols has been developed. The objectives of this Ph.D. thesis were (i) to determine the effects of novel non-thermal food processing on cranberrybush polyphenols and vitamin C; (ii) to investigate the effects of non-thermal food processing and food matrix on bioaccessibility and transepithelial transportation of bioactive compounds, in particular chlorogenic acid, from cranberrybush (Viburnum opulus) using combined in vitro gastrointestinal digestion/Caco-2 cell culture model; (iii) to obtain an effective Supercritical Anti-Solvent (SAS) coprecipitation of quercetin or rutin with polyvinylpyrrolidone (PVP), enhancing the dissolution rate, and, therefore, improving the bioavailability of these natural antioxidant compounds; (iv) to determine the effects of SAS processing and food models on the antioxidant capacity, bioaccessibility and transport dynamics of flavonol-loaded microparticles by using combined in vitro gastrointestinal digestion/Caco-2 cell culture model. To achieve these goals, four different experiments (Chapters 3-6) were conducted. Firstly, effects of high pressure processing (HPP) and pulsed electric field (PEF) treatments on physicochemical properties, bioactive compounds, antioxidant capacities and polyphenol oxidase activities of cranberrybush purée samples were evaluated (Chapter 3). Following that, non-thermal treated cranberrybush purée samples as well as cranberrybush juice/water, bovine or almond milk blends were subjected to combined in vitro gastrointestinal digestion/Caco-2 cell culture (Chapter 4). In line with the outcomes of previous chapter, in order to increase the bioavailability of some phenolic compounds that could not be absorbed across the gut epithelium after transport experiments with cranberrybush samples, the micronization of two flavonoids, quercetin and rutin, and their coprecipitation with PVP were studied by using SAS processing to increase their solubility and enhance their stability during gastrointestinal tract (Chapter 5). Finally, SAS-processed flavonoids in different simulated food models were exposed to combined in vitro gastrointestinal digestion/Caco-2 cell culture in order to investigate their transport dynamics (Chapter 6). In Chapter 1, research framework and objectives of this Ph.D. thesis are introduced. Following that, in Chapter 2, comprehensive reviews on the antioxidant properties, bioaccessibility and bioavailability of polyphenols are presented, with a specific focus on the application of novel processing techniques. Initially, a critical evaluation of the effects of novel non-thermal food processing technologies on the beverage antioxidants have been provided. Then, the studies about microencapsulation methods for food antioxidants regarding principles, advantages, drawbacks and applications have been reviewed. Afterwards, effects of encapsulation on the bioaccessibility and bioavailability of phenolic compounds were discussed. Lastly, in vitro and in vivo approaches on interactions of phenolics with food matrix were described. In Chapter 3, the effects of high pressure processing (HPP; 200-600 MPa for 5 or 15 min) and pulsed electric field treatment (PEF; 3 kV/cm, 5-15 kJ/kg) on physicochemical properties (conductivity, pH and total soluble solids content), bioactive compounds (vitamin C, total phenolic, total flavonoid, total anthocyanin and chlorogenic acid contents), antioxidant capacities (DPPH and CUPRAC assays) and polyphenol oxidase activity of cranberrybush purée samples were evaluated. Results showed that conductivity increased significantly after PEF (15 kJ/kg) treatment. PEF and HPP treatments resulted with a better retention of bioactive compounds (increase in the total phenolic content in the range of ~4 – 11% and ~10 – 14% and total flavonoid content in the range of ~1 – 5% and ~6 – 8% after HPP and PEF, respectively) and antioxidant capacity compared to untreated sample. HPP reduced residual enzyme activity of PPO comparatively better than PEF. Besides, cranberrybush polyphenols were identified along with their detected accurate mass, molecular formula, error in ppm (between the mass found and the accurate mass < 10 ppm) of each phytochemical, as well as the MS/MS fragment ions. UPLC–QTOF–MS/MS analysis of cranberrybush led to the identification of flavan-3-ols (catechin, epicatechin, epi(catechin) hexoside), proanthocyanidins (procyanidin dimer, procyanidin trimer, procyanidin dimer monoglycoside), flavonols (quercetin, quercetin-deoxyhexose, quercetin-3-O-glucoside, quercetin pentoside hexoside, rutin, isorhamnetin-3-O-rutinoside), flavone (diosmetin-rhamnosylglucoside), phenolic acids (caffeic acid, chlorogenic acid, coumaric acid, p-coumaroyl-quinic acid) as well as anthocyanins (cyanidin-3-glucoside, cyanidin-3-rutinoside and cyanidin-3-xylosyl-rutinoside). In conclusion, high retention of bioactive compounds was achieved, with a potential extraction of vitamin C, phenolics, flavonoids and anthocyanins in cranberrybush purées after HPP and PEF treatments at selected processing intensities. In Chapter 4, effects of food matrix and non-thermal food processing on bioaccessibility and transport dynamics of cranberrybush phenolics, in particular chlorogenic acid, in a combined in vitro gastrointestinal digestion/Caco-2 cell culture model were studied. Results showed that PEF treatment at 15 kJ/kg specific energy input resulted in a higher recovery of total flavonoid content (TFC; increase of 3.9% ± 1.1%, p < 0.0001), chlorogenic acid content (increase of 29.9% ± 5.9%, p < 0.001) and antioxidant capacity after gastrointestinal digestion. The present study also demonstrates that untreated and treated samples display comparable transport across the epithelial cell layer. Besides, addition of milk matrix have a positive effect on the stability and transportation of chlorogenic acid. JM increased the transport efficiency of chlorogenic acid by 3.5% ± 0.8% (p < 0.0001), while JA increased the transport of chlorogenic acid by 3.3% ± 0.5% (p < 0.001) in comparison with JW blend. The in vitro gastrointestinal digestion/Caco-2 cell culture method applied in this chapter was used in the succeeding chapter (Chapter 6). In Chapter 5, micronization of two flavonoids, quercetin and rutin, and their coprecipitation with polyvinylpyrrolidone were studied by using the SAS process. In particular, optimum conditions in terms of operating pressure, type of the solvent, total solute concentration and polymer/active ratio for the formation of spherical composite microparticles were determined. Morphology, mean size and size distribution of the particles were analyzed and discussed. The effectiveness of the process was also verified through entrapment efficiency and dissolution tests. Overall, amorphous microparticles were produced with total solute concentrations greater than 20 mg/mL. Furthermore, release studies confirmed the improvement of the flavonoids dissolution rates: 10 and 3.19 times faster dissolution rates were achieved with PVP/quercetin and PVP/rutin microparticles rather than those of unprocessed quercetin and rutin, respectively. Besides, the high entrapment efficiencies, up to 99.8%, were achieved for quercetin and rutin coprecipitates by using DMSO, which was the solvent chosen to coprecipitate the flavonoid compounds with PVP by the SAS process. Consequently, the characteristics of the powders could allow to use of these quercetin and rutin loaded microparticles in pharmaceutical and nutraceutical applications due to their high antioxidant and anticancer benefits for, in which the flavonoid compounds have high stability and bioavailability. In Chapter 6, effects of SAS processing on bioaccessibility and transepithelial transportation of quercetin and rutin were investigated by using a recognized combined gastrointestinal digestion/cell-based assay. Moreover, aqueous hydrophilic and acidic conditions were simulated to analyze food-related factors that could have an impact on the transport of these compounds across the gut epithelium. SAS processing improved the recovery of the quercetin (94 and 13 times in hydrophilic and acidic conditions, respectively) and rutin (7 and 2 times in hydrophilic and acidic conditions, respectively) after in vitro digestion. Besides, transepithelial transportation of PVP/quercetin and PVP/rutin microparticles were found to be much higher rather than unprocessed quercetin and rutin. Finally, in Chapter 7, based on the outcomes of the previous chapters, the general discussions and conclusions on the antioxidant properties, bioaccessibility and bioavailability of polyphenols were presented. The status and main outcomes of this thesis were discussed under the headings of fate of the polyphenols after application of novel non-thermal food processing techniques, effects of encapsulation on the food phenolics and interactions of phenolics and food matrix. During the discussion on the effects of encapsulation on the food phenolics, important factors to be considered during encapsulation, advantages and drawbacks of these techniques, their impacts on the antioxidant properties, bioaccessibility and bioavailability of phenolic substances were discussed. Besides, while referring to the interactions with food matrix, special attention has been paid to comparison of the different in vitro and in vivo digestion models.

Bitkilerin meyve, sebze, çiçek ve yaprakları gibi çeşitli gıdalarda bulunan fenolik bileşikler, antimikrobiyal, antioksidan, antidiyabetik, idrar söktürücü, hipoglisemik, öksürük kesici, antiinflamatuar ve antiviral aktiviteler ile kardiyovasküler, pankreas, karaciğer ve böbrek hastalıklarının önlenmesi gibi gibi pek çok faydalı etkiye sahiptir. Bununla birlikte, polifenollerin çoğunun sudaki çözünürlüğünün zayıf olması ve gastrointestinal sistemde kimyasal olarak kararsız olmaları dolayısıyla oldukça düşük bir biyoyararlılığa sahiptir. Bu nedenle, fenolik bileşiklerin çözünürlüğünü, kararlılığını, biyo-erişilebilirliğini ve biyoyararlılığını iyileştirmek için çok çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Yukarıdakiler dikkate alınarak, yeni gıda işleme tekniklerinin gilaburuda bulunan polifenollerin antioksidan kapasitesi, biyoerişilebilirliği ve biyoyararlılığı üzerindeki etkilerini çalışmak amacıyla bir araştırma çerçevesi oluşturulmuştur. Bu doktora tezinin hedefleri (i) yeni ısısal olmayan gıda işleme tekniklerinin gilaburuda bulunan polifenoller ve C vitamini üzerindeki etkilerini tespit etmek; (ii) ısısal olmayan gıda işleme yöntemleri ile gıda matrisinin gilaburuda bulunan biyoaktif bileşenlerin, özellikle klorojenik asidin, biyoerişilebilirliği ile bağırsak taşınımı üzerindeki etkilerini in vitro mide-bağırsak sindirim/Caco-2 hücre kültürü emilim modelini kullanarak araştırmak; (iii) polivinilpirolidon (PVP) ile kuersetin veya rutinin kopresipitasyonu amacıyla Süperkritik Anti-Solvent (SAS) yönteminin optimum işlem parametrelerini belirlemek; (iv) SAS işlemi ile farklı gıda koşullarının, flavonol (kuersetin ya da rutin) yüklü mikroparçacıkların antioksidan özellikleri, biyoerişilebilirliği ile bağırsak taşınımı üzerindeki etkilerini kombine in vitro mide-bağırsak sindirim/Caco-2 hücre kültürü emilim modelini kullanarak araştırmaktır. Yukarıdaki hedeflere ulaşmak için dört farklı deneysel çalışma (Bölüm 3–6) yapılmıştır. Öncelikle farklı yüksek hidrostatik basınç (HPP) ve vurgulu elektrik alan (PEF) uygulamalarının gilaburu püresinin fizikokimyasal özellikleri, biyoaktif bileşikleri, antioksidan kapasitesi ve polifenol oksidaz aktivitesi üzerindeki etkileri değerlendirilmiştir (Bölüm 3). Bunu takiben, ısısal olmayan yöntemler ile işlenmiş gilaburu püresi örnekleri ile gilaburu suyu/su, süt veya badem sütü karışımları hazırlanarak in vitro mide-bağırsak sindirim ve emilim çalışmaları gerçekleştirilmiştir (Bölüm 4). Bir önceki bölümde gilaburu örnekleri ile yapılan emilim çalışmalarından elde edilen sonuçlar doğrultusunda, bağırsak epitelinden absorbe edilemeyen bazı fenolik bileşiklerin biyoyararlılıklarını arttırmak amacıyla, bir sonraki aşamada, iki flavonoidin, quercetin ve rutin, SAS yöntemi kullanılarak mikronizasyonu ve PVP ile birlikte kopresipitasyonu çalışılmıştır (Bölüm 5). Son olarak, SAS ile işlenmiş flavonoidler farklı gıda modellerinde in vitro mide-bağırsak sindirim/Caco-2 hücre kültürü emilimine tabi tutulmuştur (Bölüm 6). İlk bölümde bu doktora tezinin araştırma çerçevesi ve hedefleri tanıtılmıştır. Bunu takiben ikinci bölümde yeni işleme tekniklerinin polifenollerin antioksidan özellikleri, biyoerişilebilirlikleri ve biyoyaralılıkları üzerindeki etkilerine ilişkin kapsamlı bir derleme sunulmuştur. Başlangıç olarak, yeni gıda işleme teknolojilerinden ve bu teknolojilerin içeceklerde bulunan biyoaktif bileşenlerin antioksidan özellikleri üzerindeki etkilerinden bahsedilmiştir. Sonrasında gıdalarda bulunan antioksidan maddelerin mikroenkapsülasyonu amacıyla kullanılan yöntemlerin prensipleri, avantajları, dezavantajları ve uygulamaları ile ilgili çalışmalar derlenmiştir. Daha sonra, enkapsülasyon işleminin fenolik bileşenlerin biyoerişelebilirliği ve biyoyararlılığı üzerindeki etkileri ele alınmıştır. Son olarak, fenolik madde – gıda matrisi etkileşimleri üzerine gerçekleştirilmiş in vitro ve in vivo yaklaşımlar anlatılmıştır. Üçüncü bölümde HPP (200-600 MPa/5-15 dk) ve PEF (3 kV/cm, 5-15 kJ/kg) uygulamalarının gilaburu püresinin fizikokimyasal özellikleri (iletkenlik, pH ve toplam suda çözünür madde miktarı), biyoaktif madde miktarı (C vitamini, toplam fenolik, toplam flavonoid, toplam antosiyanin ve klorojenik asit içerikleri), antioksidan kapasitesi (DPPH ve CUPRAC) ve polifenol oksidaz aktivitesi üzerindeki etkileri değerlendirilmiştir. Sonuçlar PEF (15 kJ/kg) uygulamasından sonra iletkenliğin önemli ölçüde arttığını göstermiştir. Ayrıca, PEF ve HPP uygulamaları ile işlem görmemiş numuneye kıyasla sırasıyla toplam fenolik madde miktarında ~%4 - 11 ve ~%10 – 14 ve toplam flavonoid madde miktarında ise ~%1-5 ve ~ %6-8 aralığında artış tespit edilmiştir. PPO inaktivasyonu üzerinde HPP uygulamasının, PEF uygulamasına kıyasla daha etkin olduğu belirlenmiştir. Bunların yanı sıra, gilaburuda bulunan polifenoller, her bir fitokimyasalın kütlesi, molekül formülü, ppm düzeyindeki hataları (bulunan kütle ile doğru kütle arasında fark <10 ppm) ve MS/MS fragment iyonları ile birlikte tanımlanmıştır. UPLC – QTOF – MS/MS analiz sonuçlarına göre gilaburuda tespit edilen polifenoller şunlardır: flavan-3-oller (kateşin, epikateşin, epi(kateşin) heksosid), proantosiyanidinler (prosiyanidin dimer, prosiyanidin trimer, prosiyanidin dimer monoglikosit), flavonoller (kuersetin, kersetin-deoksiheksoz, kuersetin-3-O-glukozit, kuersetin pentosid heksosid, rutin, izorhamnetin-3-O-rutinosid), flavon (diosmetin-ramnosilglukosit), fenolik asitler (kafeik asit, klorojenik asit, kumarik asit, p-kumaroil-kuinik asit) ve antosiyaninler (siyanidin-3-glukozit, siyanidin-3-rutinosid ve siyanidin-3-ksilosil-rutinosid). Sonuç olarak, bu bölümde sunulan deneysel çalışma sonuçları seçilen işlem koşullarında HPP ve PEF uygulamalarının, gilaburuda bulunan biyoaktif bileşiklerin miktarında artış ya da yüksek oranda korunma sağlandığını göstermektedir. Dördüncü bölümde gıda işleme yöntemleri ile gıda matrisinin gilaburu örneklerinde bulunan biyoaktif bileşenlerin, özellikle klorojenik asidin, biyoerişilebilirliği ile bağırsak taşınımı üzerindeki etkilerini incelemek amacıyla in vitro mide-bağırsak sindirim/Caco-2 hücre kültürü emilim modeli kullanılmıştır. Elde edilen sonuçlar, 15 kJ/kg spesifik enerji girdisi ile PEF işleminin, gastrointestinal sindirim sonrası toplam flavonoid içeriği (TFC; %3.9 ± 1.1% artış, p < 0.0001), klorojenik asit içeriği (%29.9 ± 5.9% artış, p < 0.001) ve antioksidan aktivitede daha yüksek bir kazanımla sonuçlandığını göstermiştir. Ayrıca, gilaburu suyuna sığır sütü ilavesi, in vitro mide-bağırsak sindirim sonrası toplam fenolik ve toplam flavonoid madde miktarları ile birlikte antioksidan kapasiteyi de olumlu yönde etkilemiştir. Sonuç olarak bu bölümde sunulan deneysel çalışma sonuçlarına göre, işlem görmüş gilaburu örneklerinde bulunan klorojenik asit ile herhangi bir işleme maruz bırakılmamış gilaburu örneklerindeki klorojenik asidin bağırsaktan taşınımlarının benzer olduğu; ortama süt ilavesinin ise ilgili fenolik asidin mide-bağırsak sistemindeki kararlılığı ve bağırsaktan geçişi üzerinde olumlu etkileri olduğu tespit edilmiştir. Bu bölümde uygulanan in vitro mide-bağırsak sindirim/Caco-2 hücre kültürü sindirim modeli daha sonra altıncı bölümde de kullanılmıştır. Beşinci bölümde SAS yöntemi kullanılarak kuersetin ve rutinin mikronizasyonu ve PVP ile birlikte kopresipitasyonu üzerine çalışılmıştır. Bu amaçla, mikro boyutta parçacık eldesi için sistem basıncı, çözücü tipi, toplam çözünür madde konsantrasyonu ve polimer/aktif oranı gibi işlem parametreleri için optimum koşullar belirlenmiştir. Ardından, elde edilen partiküllerin morfolojisi, ortalama partikül boyutu ve boyut dağılımları analiz edilmiştir. SAS yönteminin etkinliği ayrıca enkapsülasyon verimi ve suda çözünürlük testleri ile doğrulanmıştır. Genel olarak, 20 mg/mL'den daha yüksek toplam çözünen madde konsantrasyonlarında ve yüksek polimer/flavonoid oranlarında amorf yapıda mikroparçacıkların eldesi mümkün olmuştur. Ayrıca, ürünlerin sudaki çözünürlerini incelemek amacıyla salınım çalışması gerçekleştirilmiş ve SAS işlemine tabi tutulan kuersetin ve rutinin suda çözünme oranlarının işlem görmemiş kuersetin ve rutine göre sırasıyla 10 ve 3,19 kat arttığı tespit edilmiştir. Bunların yanı sıra, çözücü olarak DMSO kullanılarak elde edilen PVP/flavonoid mikroparçacıklar için %99,8'e varan enkapsülasyon verimi elde edilmiştir. Sonuç olarak, SAS uygulaması ile elde edilen flavonoid yüklü mikroparçacıkların karakteristik özellikleri, farmasötik ve gıda alanlarında, oldukça güçlü antioksidan potansiyele, yüksek kararlılığa ve biyoyararlılığa sahip takviyelerin üretilmesine olanak sağlamaktadır. Altıncı bölümde SAS yönteminin flavonoidlerin (kuersetin ve rutin) biyoerişilebilirliği ile bağırsak taşınımı üzerindeki etkilerini incelemek amacıyla in vitro mide-bağırsak sindirim/Caco-2 hücre kültürü emilim modeli kullanılmıştır. Dahası, gıda ile ilgili faktörlerin bu bileşiklerin bağırsak epitelinden taşınması üzerindeki etkilerini değerlendirmek amacıyla hidrofilik ve asidik koşullar taklit edilmiştir. Elde edilen sonuçlara göre, SAS uygulamasının, kuersetin (sırasıyla hidrofilik ve asidik koşullarda 94 ve 13 kat) ve rutinin (sırasıyla hidrofilik ve asidik koşullarda 7 ve 2 kat) biyoerişilebilirliği oldukça yüksek oranda arttırdığı bulunmuştur. Ayrıca SAS uygulaması ile bu flavonoidlerin bağırsak taşınımları da olumlu etkilenmiştir. Son olarak, yedinci bölümde, önceki bölümlerde elde edilen veriler dikkate alınarak polifenollerin antioksidan özellikleri, biyoerişilebilirliği ve biyoyararlılığı ile ilgili genel bir tartışma, sonuçlar ve gelecekteki araştırmalar için tavsiyeler verilmiştir. Bu tezden elde edilen sonuçlar yeni gıda işleme yöntemlerinin gıdalarda bulunan fenolik bileşenler üzerine etkisi, enkapsülasyon yöntemlerinin fenolik bileşenler üzerindeki etkileri ile fenolik bileşenlerin gıda matrisi ile etkilişimi başlıkları altında ele alınmıştır. Enkapsülasyon yöntemlerinin fenolik bileşenler üzerindeki etkileri tartışılırken enkapsülasyon işleminde dikkat edilmesi gereken faktörler, enkapsülasyon yöntemlerinin avantaj ve dezavantajları ile bu yöntemlerin fenolik bileşenlerin antioksidan özellikleri, biyoerişilebilirlikleri ve biyoyararlılıkları üzerindeki etkileri konularına değinilmiştir. Fenolik bileşenlerin sindirilebilirliği üzerinde gıda kaynaklı faktörlerin etkileri tartışılırken ise farklı in vitro ve in vivo sindirim modellerinden bahsedilmiştir.