Fabrication and characterization of biodegradable fibrous webs for vascular graft structures

Abstract

Cardiovascular diseases are among the most common types of non-infectious diseases, causing approximately 20 million deaths worldwide to date. Deaths caused by cardiovascular diseases, triggered by the increase in the stress level brought about by settling from rural to urban at the global level and the spread of unhealthy eating habits, increased by 21.1% between 2007 and 2017. According to the World Health Organization data, it is estimated that the annual incidence of cardiovascular disease-related mortality will increase to 23.6 million worldwide by 2030. On the other hand, while the Covid-19 pandemic, which affected the entire world, caused an unexpected increase in cardiovascular diseases, the fact that people with these types of diseases were among the ones defined as a high-risk group once again revealed the seriousness of the situation. Mild cardiovascular diseases are treated with dietary modification, lifestyle changes, and medications, while treatment options for more damaged blood vessels usually consist of bypassing a part of the autologous vessel to replace the diseased part. The use of autologous vessels requires an additional clinical procedure such as vascular integration to the damaged area, as well as taking veins from certain parts of the body such as leg vein, forearm artery, and thoracic artery for this procedure. In addition to the aforementioned risks, dimensional incompatibilities may also occur in some cases. For this reason, the necessity of finding alternative solutions in order to overcome these problems experienced in autologous vessels is among the prominent issues in recent years. Although allografts taken from donors or cadavers and xenografts procured from animals are alternatives, they cannot fully meet this need due to the lack of donor/incompatibility and their short lifespan. Replacing the damaged vessel with a vascular graft in the treatment of cardiovascular diseases is one of the preferred methods of recent times, but problems such as infection formation, risk of thrombosis, incompatibility in radial elasticity, inadequacy in cell development, especially in small-caliber vessel changes, limit surgical success. At this point, the search for new materials and constructions has come to the fore, and the design of biodegradable scaffolds that can be replaced by an autograft produced by the body over time has taken its place among the priority research topics. Although important findings have been obtained in the research that has accelerated in the last 10 years, there is no small-caliber biodegradable vascular graft that has achieved commercial success yet. In order to meet the need, it is expected from the vascular graft to provide structural support and encourage cellular activity for the body to produce its vessel. The most important step in approximating vascular grafts designs to native blood vessel structure is to optimize the surface morphology and develop a microenvironment in which cells can attach and proliferate. For this reason, the features of the graft surface should be well understood and morphological criteria should be determined. Within this thesis, a detailed literature review is realized to understand the native artery structure and an experimental study is carried in three parts including the selection of biopolymers, optimization of solution and production parameters, and morphological, structural, thermal, and chemical analyses of the structures. The first experimental part of the thesis is a preliminary study that includes the selection of biomaterials as well as optimization of solution parameters (polymer concentration and blend ratio) and production parameters (feed rate, voltage, and tip-collector distance). A literature review is performed for surfaces produced by electrospinning using low molecular weight polycaproclactone (PCL) and polylactic acid (PLA) polymers as part of this investigation. The affects of parameters like molecular weight, concentration, and blending ratio on surface morphology, smooth fiber production, and fiber diameter parameters are examined during the research work. Electrospinning parameters are systematically studied, and the influences of these parameters on fiber production are determined. Basic parameters such as voltage, feed rate, and tip-collector distance have been optimized in this context by considering the environment's temperature and humidity, as well as the characteristics of the polymer solution. In the first stage, PCL at 16, 18, and 20 % concentrations, PLA at 7, 8, and 9% concentrations and 12% concentration of PLA/PCL (25/75 and 50/50 ratios) are used for surface formation. In this context, a definite conclusion is reached about the polymers to be used in the thesis by evaluating the performances of the determined parameters in the fibrous surface formation process and the morphological properties analyzed by scanning electron microscopy (SEM); furthermore, polymer solution concentration ranges and blending ratio are determined. The results indicate that the spinnability of low molecular weight PCL (45,000 Mn) is insufficient since either bead formation or thick and discontinuous fiber-like forms are observed in all polymer concentrations while neat PLA and PLA/PCL blends have better spinnability, which allows smooth fiber production. In the second part of the thesis, higher molecular weight PCL (80,000 Mn) is introduced to the fibrous webs in order to take the advantage of its better mechanical properties and spinnability. Similar to the preliminary part, PCL, PLA and PCL/PLA blends are studied, but polymer concentration ranges are kept constant as 6, 8, and 10% for all polymeric structures. The morphologies of the electrospun webs are observed by SEM, also fiber diameter and porosity values are measured. Thus, the polymer concentration at which smooth and fine fibers are obtained is determined for neat PLA and PCL in addition to PLA/PCL blends. The hydrophobicity of the surfaces is evaluated by water contact angle analysis (WCA). Differential scanning calorimetry (DSC) is used to observe the thermal behavior of the surfaces during heating and cooling to investigate the crystallinity of the surfaces that provide insights about biodegradability processes. Although it is not possible to obtain fibers at low polymer concentrations on all polymeric surfaces, 8%, and 10% polymer concentration allow continuous fiber formation; moreover, an expected relationship between fiber diameter and porosity ratio is detected. Surfaces with the finest fibers are those with the highest porosity. On the other hand, the thermal behavior of the surfaces is in line with the literature and the highest crystallinity is that of PCL with about 40%. In the last and final part of the thesis, poly (L-lactide) (PLLA), a derivative of PLA, is also introduced in the study, and its effects on surface properties are investigated. Within the scope of developing the most suitable surface for vascular grafts, which is one of the major objectives of the study, different blending ratios for both PLA/PCL and PLLA/PCL are determined in detail. Similar to previous experimental parts, the structures are mainly subjected to SEM, Fourier-transform infrared spectroscopy (FTIR), and DSC analyses, and the effects of blend ratios on morphological, thermal, and chemical properties are investigated in details. It has been observed that the fiber diameter increases with the increase of the ratio of PLA, which has a high molecular weight, in the PCL structure, but the increase in the ratio of PLLA, which has a lower molecular weight than PCL, in the PCL structure causes a decrease in fiber diameter. It has been determined that the polymer ratio is very effective on the fiber diameter depending on the molecular weight of the polymers, and during the thermal analysis, it determines the characteristic curves in the heating and cooling processes. Selected samples of PLA100, PCL100, PLA20PCL80, PLA50PCL50, PLLA20PCL80, and PLLA50PCL50 are subjected to biodegradability analysis at 1st, 3rd, and 5th months. All samples except PLA20PCL80 showed an increase in degradation rate in consecutive months. It is thought that this exception ocuurs in the PLA20PCL80 because of the measurement accuracy. As expected and as seen in the literature research, the degradation rate of PLA (14.29% and 40%, respectively) at the end of the 3rd and 5th months is considerably higher than that of PCL (2.17% and 3.70%, respectively). On the other hand, it is observed that 50% PLA ratio in the blend considerably increases the weight loss of the surface. Moreover, the addition of PLLA on surfaces is also found to accelerate biodegradation, similar to PLA. Cell analysis (MTS) consists of the proliferation of fibroblast and human umbilical vessel endothelial cells (HUVECs), which are one of the basic cells of the native vascular structure. In the content of MTS cellular analysis, affirmative outcomes are obtained in both fibroblast cells and HUVECs compared to control samples, and it is observed that each surface is a suitable environment for cells to live. Besides, PLA appears to have a positive effect on cell viability on PCL up to 20%, and the highest cell proliferation occurred in the PLA20PCL80 sample. The findings of the experimental studies as detailed in the three stages above shed light on the best way to examine the morphological, chemical, thermal, and biological properties of a wide variety of surfaces produced from PLA, PLLA, and PCL polymers. Surfaces designed and fabricated according to the optimized parameters are promising for layered vascular graft structures. In the studies that will take place in the thesis' continuation, small-caliber vessel grafts will be designed and fabricated from these optimized surfaces with desired orientation levels, taking into account the mechanical properties of the vessels and advanced cell activities both in-vitro and in-vivo.

Kardiyovasküler hastalıklar, bulaşıcı olmayan en yaygın hastalık türleri arasında bulunup dünya çapında bugüne değin yaklaşık 20 milyon ölüme yol açmıştır. Küresel düzeyde kırsaldan kente yerleşmenin beraberinde getirdiği stres seviyesindeki artış ve sağlıksız beslenme alışkanlıklarının yaygınlaşması ile tetiklenen kardiyovasküler hastalıklardan kaynaklanan ölümler 2007-2017 yılları arasında %21,1 oranında artış göstermiştir. Dünya Sağlık Örgütü verilerine göre 2030 yılına kadar dünya genelinde yıllık kardiyovasküler hastalıklarla ilişkili mortalite insidansının 23,6 milyona çıkacağı tahmin edilmektedir. Öte yandan tüm dünyayı etkisi altına alan Covid-19 salgını, kalp ve damar hastalıklarının beklenmedik şekilde artmasına sebep olurken, yüksek risk grubu olarak tanımlanan kişiler arasında kalp-damar hastalıklarına sahip kişilerin yer alması, durumun ciddiyetini bir kez daha gözler önüne sermiştir. Hafif seyreden kardiyovasküler hastalıklar diyet modifikasyonu, yaşam tarzı değişiklikleri ve ilaçlarla birlikte tedavi edilirken daha hasarlı kan damarları için tedavi seçenekleri genellikle baypas yöntemi ile otolog damarın bir bölümünün hastalıklı kısmın yerini almasından ibarettir. Otolog damarların kullanımı hasarlı bölgeye damar entegrasyonunun yanı sıra bu işlem için bacak toplardamarı, ön kol arteri, göğüs arteri gibi vücudun belirli bölgelerinden damar alma işlemi gibi fazladan bir klinik işlem gerektirmekte ve bu işlem şeker hastalığı, obezite ve benzer kronik rahatsızlıkları olan ve önceden kalp ameliyatı geçirmiş hastalar için büyük risk taşımaktadır. Bu risklerin yanı sıra bazı durumlarda boyutsal olarak uyumsuzluklar da yaşanabilmektedir. Bu sebeple otolog damarlarda yaşanan sıkıntıların üstesinden gelebilmek adına alternatif çözümler bulmanın gerekliliği son yıllarda öne çıkan konular arasındadır. Donör veya kadavradan alınan alogreftler ve hayvanlardan tedarik edilen ksenogreftler birer alternatif olmalarına rağmen donör eksikliği/uyuşmazlığı ve kısa ömürlü olmaları nedeni ile tam olarak bu ihtiyacı karşılayamamaktadır. Kardiyovasküler hastalıkların tedavisinde hasarlı damarın vasküler greftle değiştirilmesi ise son zamanların tercih edilen yöntemlerinden biri konumundadır ancak özellikle küçük çaplı damar değişimlerinde yaşanan enfeksiyon oluşumu, tromboz riski, radyal elastisitede uyumsuzluk, hücre gelişiminde yetersizlik gibi sorunlar, cerrahi başarıyı kısıtlamaktadır. Tam da bu noktada yeni malzeme ve konstrüksiyon arayışları gündeme gelmiş, biyobozunur özellikte olup zamanla yerini vücudun kendi ürettiği bir otogrefte bırakabilecek iskelelerinin tasarımı öncelikli araştırma konuları arasında yerini almıştır. Son 10 yılda hız kazanan araştırma konusunda önemli bulgular elde edilmiş olmasına rağmen, henüz ticari başarı elde edebilmiş küçük çaplı biyobozunur vasküler greft bulunmamaktadır. Bu noktada oluşan ihtiyacı giderme hususunda vasküler greftten vücudun kendi damarını üretebilmesi için geçecek süre boyunca yapısal destek sağlaması ve hücresel aktiviteyi teşvik etmesi beklenir. Vasküler greftler tasarımlarını gerçek damar yapısına yaklaştırmadaki en önemli adım yüzey morfolojisini optimize etmek ve hücrelerin tutunup yaşayabileceği bir mikro-çevre geliştirmektir. Bu nedenle, greft yüzeyinin taşıması gereken özellikler etraflıca kavranmalı ve morfolojik kriterler belirlenmelidir. Tez kapsamında, gerçek damar yapısı araştırılmış ve greft yüzeyinin sunması gereken yüzey özellikleri dikkate alınarak biyomalzeme, çözücü sistemi ve üretim yöntemi gibi temel parametrelerin optimizasyonu üzerine üç temel çalışma gerçekleştirilmiştir. Tezin ilk çalışması bir ön çalışma niteliğinde olup biyomalzemelerin seçimi, konsantrasyon, moleküler ağırlık ve karışım oranı belirlenimi kriterlerini içermektedir. Bu çalışma kapsamında, elektrospinning yöntemi ile PCL ve PLA polimerleri kullanılarak üretilen yüzeyler için literatür araştırması yapılmıştır. Araştırma sürecinde moleküler ağırlık, konsantrasyon ve karışım oranı gibi parametrelerin yüzey morfolojisi, düzgün lif oluşumu ve lif çapı parametreleri üzerinde etkileri incelenmiştir. Diğer yandan, elektrospinning parametreleri de detaylıca araştırılmış ve bu parametrelerin lif üretimi üzerindeki etkileri tespit edilmiştir. Bu bağlamda ortamın sıcaklık ve nem değerleri ile birlikte polimer solüsyonunun özellikleri de göz önünde bulundurularak voltaj, besleme hızı ve uç-toplayıcı mesafesi gibi temel parametreler optimize edilmiştir. İlk etapta %16, 18 ve 20 konsantrasyonlarda PCL (45,000 g/mol moleküler ağırlık), %7, 8 ve 9 konsantrasyonlarda PLA ve %12 sabit konsantrasyonda PLA/PCL (25/75 ve 50/50 oranlarda), yüzey oluşumu için kullanılmıştır. Bu bağlamda, belirlenen parametrelerin fibröz yüzey oluşturma sürecindeki performansları değerlendirilmiş ardından tez kapsamında kullanılacak olan polimerler, polimer solüsyonu konsantrasyon aralıkları ve karışım oranı belirlenmiştir. Elde edilen sonuçlar doğrultusunda PCL'nin moleküler ağırlığının lif oluşumu noktasında yetersiz kaldığı ve konsantrasyon değerleri ile birlikte üretim şartlarının tekrar optimize edilmesi gerektiği kanısına varılmıştır. Bununla birlikte, daha karşılaştırılabilir sonuçlar için PLA polimerinin konsantrasyon aralıklarının daha geniş belirlenmesi gerektiğini ve %12'lik konsantrasyonda çalışılan 50/50 oranındaki PLA/PCL karışımının tatmin edici sonuçlar verdiği ilk çalışmanın çıktıları arasındadır. Ön çalışma ışığında belirlenen özellikler neticesinde, ikinci çalışma kapsamında yüzeylerin en verimli düzeyde üretilebileceği konsantrasyon aralıkları incelenmiştir. Tüm polimer ve polimer karışımları için üç farklı konsantrasyon aralığı sabit tutulmuş ve yüzey özellikleri analiz edilmiştir. Yüzeyler öncelikler taramalı elektron mikroskopu (SEM) analizine tabi tutulup morfolojileri gözlemlenmiş ve sonrasında lif çapı ile gözeneklilik analizi gerçekleştirilmiştir. Lif çaplarının 2.5 µm'den az olduğu tespit edilmiş ve lif çapları ile gözeneklilik değerleri arasında tutarlı bir ilişki tespit edilmiştir. Lif çapının en ince olduğu yüzelerin gözeneklilik oranı en fazla olup hücresel çalışmalar için umut vaadetmektedir. Bu analizler sonucunda, düzgün ve ince lif eldesinin sağlandığı konsantrasyon PLA, PCL ve PLA/PCL bazlı yapılar için belirlenmiştir. Diğer bir morfolojik analiz olan su temas analizi ile üretilen yüzeylerin su emiciliği ve hidrofobik/hidrofilik karakteri test edilmiş, ayrıca literatür bilgilerinin sağlaması yapılmıştır. Literatür çalışmalarında da teyit edildiği üzere üretilen tüm yüzeylerin hidrofobik karakterde olduğu gözlemlenmiştir. Fourier Transform Kızılötesi Spektroskopisi (FTIR) analizi ile ise üretilen yüzeyler üzerinde çözücü kalıntısı kalıp kalmadığı üzerine yorumlar yapılmıştır. Yüzeylerde ana polimerlerin karakteristik pikleri hem saf polimerik yüzeylerde hem de karışım yüzeylerinde gözlemlenmiş ve yüzeylerde herhangi bir çözücü kalıntısı kalmadığı saptanmıştır. FTIR analizini yanı sıra, yüzeylerin ısıtma ve soğutma esnasındaki termal davranışlarının gözlemlenmesi adına Diferansiyel Taramalı Kalorimetre (DSC) cihazı kullanılarak veriler elde edilmiştir. Termal analizler, yüzeylerin kristaliniteleri ile ilgili bilgiler sağlamış ve bu DSC analizi sonuçları doğrultusunda biyobozunurluk süreçleri ile ilgili öngörü edinimine yardımcı olmuştur. PLA100, PCL100 ve PLA50PCL50 olmak üzere üç numune üzerinde yapılan termal karakterizasyonlarda, polimerlerin kendilerine özgü erime ve kristalizasyon eğrileri tespit edilmiş ayrıca polimerlerin kristalinite değerleri de hesaplanmıştır. Beklendiği üzere, yaklaşık %40 ile en yüksek kristalinite değeri PCL polimerinde görülmüştür. Son ve nihai çalışmada ise bir PLA türevi olan PLLA da çalışmaya dahil edilmiş ve yüzey özellikleri üzerindeki etkileri incelenmiştir. Çalışmanın ana amaçlarından biri olan vasküler greftlere en uygun karışım yüzeyinin geliştirilmesi kapsamında hem PLA/PCL hem de PLLA/PCL karışımları için farklı karışım oranları kullanılarak gözlemler yapılmıştır. Diğer çalışmalara benzer şekilde yüzeyler yüzey görüntülenmesi, lif çapı, gözeneklilik ve DSC analizlerine tabi tutulmuştur ve yapıdaki PLA, PLLA ve PCL oranının bu özellikler üzerindeki etkileri incelenmiştir. Yüksek moleküler ağırlığa sahip olan PLA'nın PCL yapısı içindeki oranının artmasıyla lif çapının arttığı fakat moleküler ağırlığı PCL'den daha düşük olan PLLA'nın PCL yapısındaki oranının artışının lif çapında bir azalmaya neden olduğu gözlemlenmiştir. Polimerlerin moleküler ağırlığına bağlı olarak lif çapı üzerinde polimer oranının oldukça etkili olduğu, termal analiz esnasında ise ısıtma ve soğutma süreçlerinde karakteristik eğrilerin belirginliğini belirlediği tespit edilmiştir. Öte yandan nihai çalışma kapsamında PLA100, PCL100, PLA20PCL80, PLA50PCL50, PLLA20PCL80 ve PLLA50PCL50 seçili yüzeyleri için biyobozunurluk ve hücre analizleri gerçekleştirilmiştir. Hücre analizleri, gerçek damar yapısının temel hücrelerinden olan fibroblast ve insan umbilikal damar endotel hücrelerinin (HUVEC) yüzeylere tutunma ve yayılma adımlarını içermektedir. PLA20PCL80 haricindeki tüm numunelerde, birbirini takip eden aylarda (1, 3 ve 5nci aylarda) bozunma oranında artış görülmüştür. PLA20PCL80'deki bu istisnanın ölçüm hassasiyetinden kaynaklı olduğu düşünülmektedir. Beklendiği ve literatür araştırmalarında görüldüğü üzere 3 ve 5nci ayların sonunda PLA'nın bozunma oranı (sırasıyla %14.29 ve %40), PCL'ninkinden (sırasıyla %2.17 ve %3.70) oldukça yüksektir. Diğer yandan, harman içindeki %50 PLA oranının yüzeyin kütle kaybını oldukça artırdığı gözlemlenir. Dahası, yüzeylerdeki PLLA eklentisinin de PLA'ya benzer şekilde biyobozunmayı hızlandırdığı tespit edilir. 12 ay boyunca devam edecek olan biyobozunurluk testinin gelecek çalışmalarda daha sağlıklı sonuçlar vereceği tahmin edilmektedir. Biyolojik gözlemleri kapsayan MTS hücresel analizi kapsamında, kontrol numunelerine kıyasla hem fibroblast hücrelerinde hem de HUVEClerde olumlu sonuçlar elde edilmiş, her bir yüzeyin hücrelerin yaşayabilmesi için uygun bir ortam olduğu gözlemlenmiştir. PLA'nın %20 orana kadar PCL üzerinde hücre yaşayabilirliği konusunda olumlu etkisinin olduğu görülmektedir ve en fazla hücre proliferasyonu PLA20PCL80 numunesinde meydana gelmiştir. Sonuç olarak, tez kapsamındaki tamamlanan üç temel çalışma, tez konusunun yeni ve geliştirilebilir yönlerini göstermektedir. Optimize edilen parametreler doğrultusunda tasarlanan yüzeyler, devam eden bu çalışmanın hedef yapısı olan katmanlı vasküler greft konstrüksüyonları için umut vadetmektedir. Tezin devamında yapılacak olan çalışmalarda, damarın mekanik özellikleri de göz önünde bulundurularak oryante bir yapıya sahip, küçük çaplı vasküler greftler oluşturulacaktır. Ardından hem in-vitro hem de in-vivo ortamdaki hücresel aktivitelerinin yanı sıra vasküler greftten otolog kan damarı oluşum süreçleri gözlemlenecektir.