Candida Methylica Kaynaklı Nad+- Bağımlı Format Dehidrojenaz Enziminin Koenzim Özelliğinin Rasyonel Dizayn İle Değiştirilme Denemeleri

Abstract

Bu çalışmada, Candida methylica format dehidrojenaz enziminin NAD+ ‘olan koenzim spesifikliği, rasyonel dizayn yöntemi ile, cmFDH geninde yapılacak tek ve çift mutasyonlar ile değiştirilerek NADP+’ ye özel hale getirilmeye çalışılmaktadır. NAD(P)H büyük oranda ilaç sanayinde kullanılan, kiral moleküllerin biyosentezinde sıklıkla kullanılan bir koenzimdir. NAD(P)H’nin ucuz ve verimliliği yüksek yöntemle elde edilebilir olması, sentezlenmesi zor ve pahalı olan birçok kiral molekülün ucuz yolla sentezlenmesine ve buna bağlı olarak da günümüzde kullandığımız ilaçların ucuzlamasına katkıda bulunacaktır. Bu projede, koenzim olarak NAD+ kullanan cmFDH enzimini Aspartik asit 195→Serin (D195S) ve Tirozin 196→Arjinin (Y196R) mutasyonlarını gerçekleştirerek NADP+ koenzimini kullanabilir hale getir,lmesi amaclandı. Aday aminoasitler, önceki çalışmalarla ortaya konmuş, saccharomyces cerevisiae (sceFDH), candida boidinii (cbFDH) and cmFDH enzimlerinin homoloji modellerinden faydalanılarak belirlendi. İlk defa bu çalışma ile cmFDH enziminin 195. ve 196. pozisyondaki aspartik asit ve tirosin amino asitleri yönlendirilmiş mutasyon tekniği ile serin ve arjinin aminoasitleriyle yerdeğiştirilerek NADP+ koenzimine bağlanabilme özelliği kazandırılmaya çalışıldı.

In this study, it is aimed to introduce a single and douple mutations in the principle of rational design to change the substrate specifity of candida methylica formate dehdrogenase (cmFDH) to remove the absolute requirement for NAD+ over NADP+ shown by the wild type enzyme. NAD(P)H is commonly used as a coenzyme for synthesis of chiral compounds, which are being used in large amounts in pharmacy. So, synthesis of NAD(P)H with a cheap and effective recovery system is very important challeging task to lower the cost of drug production. In this project, cmFDH with its coenzyme specificty has been tried to change from NAD+ to NADP+ by indroducing one single; Aspartic acid195→Serine(D195S) and one douple ;Aspartic acid195→Serine(D195S) together with Tyrosine196→Arginine (Y196R) point mutations. The candidate aminoacids were detected based on the previous results of homology remodeling of a NAD+ specific FDH from saccharomyces cerevisiae (sceFDH), candida boidinii (cbFDH) and cmFDH. It is the first time in the cmFDH enzyme, aspartic acid and tyrosine positioned respectively at 195th and 196th were replaced with serine and arginine respectively via site directed mutagenesis to enable enzyme to bind NADP+.