Methanocaldococcus Jannaschii’nin Putatif İki Glutamat Sentaz Alt Ünitesinin Heterolog Ekspresyonu

Abstract

lutamat sentaz (GOGAT) amonyak asimilasyonun erken basamaklarında görev alan kilit bir enzimdir. Glutamat sentaz, glutaminin amido azotundan 2-okzoglutarata indirgeyici bir transamidasyon reaksiyonuyla iki molekül glutamat oluşumunu, katalizler. Glutamat sentaz bakterilerde, alglerde, mantarlarda, bitkilerde ve son olarak da ilkel hayvanlarda tanımlanmıştır. Glutamat sentazlar moleküler ağırlıkları, alt ünite kompozisyonları, elektron verici özgüllükleri bakımından farklılık gösterirler. Genellikle bakterilerde NADPH bağımlı iki farklı alt üniteli, bitkilerin yeşil organlarında Ferrodoksin bağımlı bir alt üniteli, fotosentetik olmayan organlarında ise yine tek alt üniteli fakat NADH bağımlı olarak bulunurlar. Üzerinde tartışmaların devam ettiği bir çalışma hariç şuana kadar hiçbir arkeal glutamat sentaz tanımlanmamıştır. Bu çalışmada, Methanocaldococus jannschii’nin putatif iki glutamat sentaz alt ünitesi, MJ130 ve MJ1351, heterelog olarak, Escherichia coli’de ekspres edilmiştir. Bir üçüncü alt ünite olarak da MJ1351.1 saptanmış ve klonlanmıştır. Biyokimyasal olarak tanımlanmış glutamat sentazlara karşı, amino asit dizisi düzeyinde yapılan homoloji analizlerine göre; MJ1350 glutamat sentazların β heliks bölgesine, MJ1351 aynı anda hem sentaz hem de merkezi bölgelere ve MJ1351.1 ise glutamin amido transferaz bölgesine benzerli gösterdiği saptanmıştır.

Glutamate synthase abbreviated as GOGAT is a key enzyme in the early stages of ammonia assimilation. It catalyzes the reductive transamidation of amido nitrogen from glutamine to 2-oxoglutarate to form two molecules of glutamate. Glutamate synthase is found in bacteria, algae, fungi, plants and lower animals. Glutamate synthases are differ in their electron donor specificity, subunit composition and molecular weight. It is generally found; NADPH dependent with two nonidentical subunit in bacteria, Ferrodoxin dependent monomeric in green tissues of plants and NADH dependent monomeric in nonphotosyntetic tissues of plants. Reports about glutamate synthase from the archaea, however, are currently not available except one study, but it is still very controversial. In this study two putative glutamate synthases subunits, MJ1350 and MJ1351 from the hyperthermophilic and barophilic archaeon were expressed in Escherichia coli. An other ORF, MJ1351.1, was identified to be the third subunit of M. jannaschii glutamate synthase and MJ1351.1 was cloned. In bioinformatic studies MJ1350 showed similarity to β helix domain, MJ 1351 showed to both central and synthase domains of glutamate synthases together, MJ1351.1 showed similarity to glutamine amido transferase domain, when the deduced amino acid sequences were compared with biochemically characterized glutamate synthases.