Bacillus Subtilis’te Ywfh Geninin İfadesi Üzerine Etki Eden Global Düzenleyici Faktörlerin “electrophoretıc Mobılıty Shıft Assay” Metodu İle Analizi

Abstract

Basilisin, Bacillus subtilis tarafından sentezlenen, L-alanin ve L-antikapsin’den oluşan bir dipeptit (125 kDa) antibiyotiktir. Yakın zamanda, B. subtilis’in basilisin biyosentezinde bir polisistronik operon ywfBCDEFG ve bitişiğindeki monosistronik gen ywfH in görev aldığı bulunmuştur. Önceden, basilisin biyosentezinin hücre yoğunluğu sinyali döngüsünün kontrolü altında gerçekleştiği gösterilmiştir. Ek olarak, basilisin üretiminin global düzenleyici Spo0A tarafından direk olarak, pozitif yönde düzenlenirken, geçiş evresi düzenleyicileri CodY ve AbrB tarafından direk olarak, negatif yönde düzenlendiği bulunmuştur. Çok yakın zaman içinde bu global düzenleyicilerin bac operonunun ifadesi üzerindeki etkisi ve bu global düzenleyicilerin bac promoter bölgesi ile olan etkileşimleri keşfedilmiştir. AbrB ve CodY proteinleri bac promotörünü doğrudan baskılayan negatif düzenleyicilerken, ComA ve Spo0A, bac operonun geçiş evresinde direk uyarılmasını sağlayan, pozitif yönde hareket eden düzenleyiciler olduğu gösterilmiştirdir. Bir sonraki çalışma olarak, bu çalışmada, ywfH promotörünün ComA, CodY, AbrB, Spo0A, ve DegU global düzenleyiciler için doğrudan hedef olup olmadığını “Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)” yöntemi kullanarak tanımlanması amaçlanmıştır. Bu amaçla, 414bç DNA parçasını içeren ywfH promotör bölgesi, saflaştırılmış C-ucu His6 kuyruklu ComA, Spo0A, AbrB, CodY ve DegU proteinlerinin çeşitli konsantrasyonları ile inkübe edilmiştir. Bunun dışında, AbrB-CodY, Spo0A-ComA, ComA-ComK ve ComA-DegU’nun eş zamanlı mı veya yarışmacı olarak mı PywfH‘ne bağlandığını belirlemek amacıyla iki düzenleyici proteinin varlığında “jel mobility shift” yöntemi tekrarlanmıştır.

Bacilysin is a dipeptide antibiotic (125 kDa) composed of L-alanin and L-anticapsin in Bacillus subtilis. Recently, it was found that a polycistronic operon: ywfBCDEFG and adjacent monocistronic gene: ywfH were essential for the production of bacilysin. Previously it was shown that biosynthesis of bacilysin is under the positive control of quorum sensing global regulatory circuit. Additionally, bacilysin production is also positively regulated by global regulatory factor Spo0A and negatively regulated by transition state regulators, CodY and AbrB. Very recently, the effects of global regulatory factors ComA, Spo0A, CodY and AbrB on the expression of bac operon and their interaction with the promoter region of bac operon were investigated. It was shown that ComA and Spo0A act as a positive regulator which participates in the transition state induction of bac operon both directly by interacting with the bac promoter while AbrB and CodY are negative regulators which directly repress the bac promoter. As a further study, the present study aims to identify whether ywfH promoter is direct target for the global regulators; ComA, CodY, AbrB, Spo0A and DegU by using “Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)”. For this purpose, the 414 bp DNA fragment harboring the promoter region of ywfH were incubated with the various concentrations of the purified C-terminal His6-tagged-ComA, -Spo0A, -AbrB, -CodY, -DegU proteins. Moreover, the gel mobility shift assays were repeated in the presence of both regulatory proteins to determine whether AbrB-CodY, Spo0A-ComA, ComA-ComK and ComA-DegU could bind to ywfH promoter simultaneously or compete for binding.