Yüzeyce Güçlendirilmiş Raman Spektroskopisi İle Protein Karakterizasyonu İçin Aao Şablonlar İle Altlık Üretimi

Abstract

Raman etkisinin keşfedilmesi fizik, kimya ve malzeme biliminde çok önemli ilerlemelere neden olmuştur. Fakat göreceli olarak zayıf bir saçılma olan Raman saçılması keşfedilmesinin üzerinden geçen süre zarfında ilk etkisini yitirmiş ve kızılötesi saçılma sektroskopisi gibi yöntemlere kıyasla çok kullanılmayan bir yöntem haline gelmiştir. Bu durum 1974 yılında “yüzeyce güçlendirilmiş Raman saçılmasının” (SERS) bulunması ile son bulmuş ve bu alana olan ilgi tekrar artmıştır. Yüzeyce güçlendirilmiş Raman saçılması, isminin de belirttiği üzere nano boyutta yapılandırılmış malzemelerinin yüzey özelliklerinin uygun bir ışık kaynağı ile uyarılması sonucu ile oluşan ve yüzeye çok yakın bir bölgede bulunan moleküllerden alınan Raman saçılmasını kuvetlendirici etkiye sahip bir yöntemdir. Bu sayede çok düşük miktarlardaki moleküllerin bile Raman sinyalleri güçlü bir şekilde alınmakta ve moleküllerin tanımlanması yapılabilmektedir. Bu yöntemde gözlemlenen güçlenmenin iki temeli vardır. Bunlardan ilki “elektromanyetik kuvvetlenmedir”. Elektromanyetik etki, metal yüzeyine düşen ışığın, yüzey plazmonlarını uyarması ve bu yüzey plazmonlarının toplu şekilde salınım yaparak bir elektrik alan oluşturması ile oluşur. Bu elektrik alan içerisinde bulunan molekülden gelen Raman saçılması ise elektrik alanın etkisiyle kuvvetlenmiş olarak ölçülür. İkinci güçlenme mekanizmasının ise moleküllerin elektronik bulutu ile metal yüzeyinin elektronik alanı arasında bir şarj iletimi oluşması yoluyla meydana geldiği düşünülmektedir. Kimyasal bağlanma kaynaklı bu etkinin toplam kuvvetlenmeye katkısı elektromanyetik etkiye oranla çok daha düşüktür. Görüldüğü üzere SERS yöntemi ile Raman analizi yapılabilmesinin ilk kuralı uygun malzemelerden nano yapılı düzenenli ve kontrollü yüzeylerin hazırlanmasıdır. Bu tez çalışmasının üç temel hedefi vardır. Bunlar 1) SERS için uygun yüzeylerin (altlıkların) anodik alüminyum oksit içerisine maskeleme yöntemi kullanılarak doğru akım altında elektrokimyasal olarak biriktirilmesi, 2) hazırlanan yüzeylerin SERS etkinliğinin optimize edilmesi (en/boy oranlarının kullanılan uyarıcı ışık kaynağı altında en şiddetli kuvvetlenmeyi vermesi için ayarlanması), SERS kuvvetlenme faktörürünün hesaplanması ve hazırlanan altlıkların biyolojik moleküller için uygunluğunun denenmesi, 3) üretilmiş ve optimize edilmiş olan nanoyapılı yüzeyler üzerinde SERS yöntemi ile “altına özgü olarak bağlanan peptidlerin” (GBP) bağlanma mekanizmalarının yüzey yükü değiştirilerek incelenmesi ve bu sayede farklı yüzey yüklerinde peptid-altın ilişkisinin irdelenmesi. Şimdiye kadar kullanılan geleneksel SERS altlıkları çoğunlukla çözelti içerisindeki kolloidal nanoparçacıklar, elektrokimyasal yöntemlerle pürüzlülüğü arttırılmış elektrot yüzeyleri ve litografik yöntemlerle üretilmiş yüzeylerden oluşmaktadır. Pürüzlü yüzeylerde kontrolsüz düzensizlikler nedeniyle homojen bir yapı elde xxiii edilememktedir, bu durum da yapılan ölçümlerin tekrarlanabilir olmasını engellemektedir. Kolloidal çözeltilerde topaklanma sorunu mevcuttur ve dolayısıyla da elde edilen sonuçların verimsiz ve tekrar edilemez olması problemleri vardır. Düzensizlik ve kontrolsüz yüzey özellikleri sorunlarını çözen litografik yötemler ise çok pahalı ekipmanlar gerektirmekte olup, zaman alan ve üretilebilen yüzey alanı çok sınırlı olan zahmetli prosedürlerdir. Bu nedenle nano yapılı yüzeylerin elde edilmesinde uzun zamandır kullanılmakta olan anodik alüminyum oksit (AAO) ile maskeleme yöntemi SERS altlıklarının üretilmesi için ideal bir yöntem olarak karşımıza çıkmaktadır. Zahmetsiz ve hızlı bir şekilde, saf alüminyumun asidik bir elektrolit içerisinde anodik olarak polarizasyonu sonucu düzgün altıgen boşluklara sahip bal peteği dokulu bir oksit yapısı elde edilir. Yapının boşluk çapı, derinliği, boşluklar arası mesafe gibi özellikleri anodizasyon parametrelerine bağlı olup, bu parametreler üzerinden yapılan değişiklikler ile kontrol edilebilmektedir. Bu yapının direk olarak elektrokimyasal malzeme biriktirme yönteminde maske olarak kullanılmasına tek engel ise nano boşlukların tabanında oluşan ve elektrik geçişine engel olan yalıtkan oksit tabakasının varlığıdır. Bu nedenle AAO maskelerin alüminyum altlığından ayrılıp boşlukların kimyasal yöntemlerle tabanlarının açılması gerekmetedir. Bu işlem ise çok kırılgan ve boşluk çapları değişken maskeler elde edilmesine neden olur. Oysa alüminyum teknolojisinde uzun zamandır kullanılmakta olan fakat nano yapılı AAO yüzeylere ilk defa grubumuz tarafından uygulanan çinkolama işlemi ile tabandaki yalıtkan oksit tabakanın yerine çok ince bir çinko kaplaması basit bir şekilde biriktirilmiştir. Bu sayede AAO taban alüminyum metalinden ayrılmadan iletken hale gelmektedir. Bu tezde çinkolama işlemi AAO yüzeyler için ilk defa optimize edilmiş ve AAO’in boşluklarının büyüme mekanizması sıcaklık ve zaman değişkenlerine göre kontrol altına alınmıştır. Daha sonra hazırlanan ve boşluk dipleri iletken hale gelmiş olan AAO maskeler, nikel, altın ve gümüş metallerinin doğru akım altında elektrokimyasal olarak biriktirimesinde kullanılmıştır. Elektrokimyasal biriktirme sonrasında aluminium altlık ve AAO tabakaları çözülerek, kendiliğinden ayakta durabilen, düzgün metal nanotel yüzeyler elde edilmiştir. Nanotel çapları ortalam %70 oraında 100-150 nm arasındadır. Bu yüzeylerin SERS altlığı olarak optimizasyonu, boy/çap oranlarına göre yapılmış ve iki örnek molekül kullanılarak doğrulanmıştır. Boy/çap oranının metalik nanotellerde yüzy plazmonlarının oluşmasında çok önemli bir faktör olduğu bilinmektedir. Yüzeylerin optimizasyonunda kullanılan moleküllerden ilki (Rhodamine 6G) SERS kuvvetlenmesinin hesaplanması için kullanılmış ve yüzeylerin kuvvetlendirme faktörü 5x106 olarak hesaplanmıştır. Ikinci molekül olan “bovine serum albumin” (BSA) ise yüzeylerin protein moleküllerinin incelenmesi için uygunluğunun test edilmesi amacı ile incelenmiştir. Bu çalışmadan alınan sonuçlar, literatürdeki sonuçlar ile karşılaştırıldığında göstermiştir ki, üretilmiş olan altlık malzemeleri ile protein moleküllerinin yüzeye bağlanma ve bu yüzeylerdeki davranışlarını incelemek mümkündür. BSA molekülünün yüzey üzerinde konformasyonunun bozulmadan kaldığı ve SERS spektrumunda tüm önemli bağlarının görüldüğü belirtilmiştir. Bunun yanı sıra üretilen altlıkların yüzey özelliklerinin Raman kuvvetlendirmesini tüm yüzeyde tutarlı bir şekilde yaptığı, yüzeylerin tekrar kullanılabilir olduğu ve farklı ışık kaynakları ile uyarılmanın gerekmesi durumunda anodizasyon parametrelerinde değişiklikler yapılarak uygun ebatlarda üretilebileceği gösterilmiştir. Tüm bu özellikler AAO yöntemi kullanılarak hazırlanan SERS altlıklarının çok hassas ölçümler yapılması gereken biyolojik çalışmalar için ideal xxiv olduğunu kanıtlamıştır. Ayrıca altlıkların kolay üretilebilir, dayanıklı olması ve geleneksel altlık malzemelerinin aksine SERS SERS yönteminin küçük peptidelerin yüzeye bağlanma özelliklerinin incelenmesi için çok uygun bir yöntem olduğu yapılan literature araştırmaları sonucu anlaşılmıştır. SERS etkisi yüzeyden uzaklaştıkça azalmakta olduğundan peptid spektrumlarında en şiddetli elde edilen pikler, peptidin yüzeye hangi bölgesi ile bağlandığı hakında bilgi verebilmektedir Malzeme-peptid yüzey etkileşimlerinin ne şekilde gerçekleştiğinin anlaşılması çok fonksiyonlu melez nano yapıların üretilmesi açısından önemlidir. Özellikle yüzeylere özgül olarak bağlanma özellikleri olan kombinatoriyal genetik yöntemlerle seçilmiş peptidlerin bağlanma mekanizmalarının anlaşılmasında, SERS sonuçlarının atomik kuvvet mikroskobu, nükleer manyetik rezonans ve kuvars kristal mikro terazi ölçümleri ile elde edilmiş olan sonuçlar ile beraber yorumlanması çok önemli bilgilere ulaşılmasına olanak verir. Özellikle altına özgü olarak bağlanan peptidlerin tanımlanması ve bağlanma özelliklerinin incelenmesini içere bir çok çalşma mevcut olmasına rağmen bağlanma mekanizması halen tam olarak anlaşılmış değildir. Çalışmalar peptidin yüzeyi geleneksel thiol bazlı mekanizmalar üzerinden değil de elektrostatik ve hydrofobik etkileşimler sonucu tanımakta olduğunu ortaya koymaktadır. Bu çalışmada kullanılan model peptid MHGKTQATSGTIQS amino asit dizisinin üç kere tekrar edilmesi ile oluşan 3rGBP peptididir. Altına bağlanan peptidlerin, dört farklı yüzey yükü altında bağlanma mekanizmaları SERS tekniği kullanılarak literatürde ilk defa incelenmiştir. Yüzey yükü üzerinde yapılan değişilikler bu peptidle ilgili var olan çalışmalarn yapıldığı nötral pH olan 7.4 temel alınarak incelenmiştir. 7.4 pH değerinde peptidin toplam yükü + 3’tür. Diğer pH değerlerinde yükler sırasıyla +6 (pH 4.5), izoelektrik nokta (pH 10.28) ve -1 (pH 12) olarak seçilmiştir. Çözelti pH’ında yapılan değişikliklerin metal-çözelti arayüzeyindeki yük dengesini de değiştirmektedir. Bu değişikliğin sonucunda bağlanma mekanizmasında olan değişiklikler daha önce elektrokimyasal kuvars kristal mikroterazi yöntemi ile detaylı olarak grubumuz içerisinde incelenmiştir. SERS ile yapılan bu çalışmada alınan sonuçlar ise daha önce yapılmış olan çalışmaları desteklemektedir. Buna göre GBP’ler elektrostatik çekim kuvvetleri ve hidrofobik etkileşimler sonucunda yüzey yükündeki değişimlere bağlı olarak farklı amino asit bölgeleri ile yüzeyle etkileşime geçmektedir.Ayrıca peptidin yüzeye normal şartlar altında bağlanması beklenmeyen koşullar altında bile konformasyonunu değiştirerek yüzey ile dinamik bir denge oluşturmakta ve neredeyse tüm amino asitlerini kullanarak yüzeye temas etmektedir. Bu çalışmanın sonucunda SERS yönteminin, uygun altlık malzemeleri kullanılması durumunda, özellikle biyolojik moleküllerin incelenmesi ile ilgili çalışmalarda çok etkin olduğu anlaşılmıştır. Aynı yöntemin altın nanotel yüzeyler yerine diğer teknolojik öneme sahip ve plazmonik özellikler gösteren metaller ile altlıkların üretilmesi durumunda anorganiklere özgül bağlanan diğer peptidlerin de incelenesi kullanılabileceği öngörülmektedir. Üretilen altlıkların büyük yüzey alanına sahip olması, kolay üretilebilir olması, temizleme işlemleri sonrası yapılarının bozulmadan tekrar kullanılabilir olması en önemli özellikleridir.

The discovery of the Raman effect (and following the Raman spectroscopy technique) was an important step in physical, chemical and analytical sciences. After its discovery there has been a great surge of interest to the field but very soon the weaknesses of the Raman scattering stalled the progress of the technique. In 1974 another equally important breakthrough bridging Raman effect with nanotechnology and materials science has regenerated the scientific public’s attention to the subject. The novel technique, named later as “surface enhanced Raman spectroscopy” (SERS), made possible to analyse and detect the Raman signals of even trace amounts of molecules placed in the very close vicinity of noble metallic nanostructures when excited with light. SERS take its route from two separate enhancement mechanisms, which act cumulatively. The first and biggest part of the enhancement comes from the so-called “electromagnetic enhancement” mechanism. The smaller contribution is coming from a chemical (or charge-transfer) enhancement mechanism. Since the electromagnetic mechanism is the biggest contributor to SERS therefore controlling the enhancement through careful tailloration of metallic nanostructures is the key point in fabricating well-performing SERS substrates. So far, conventional substrates such as electrochemically roughened electrode surface or colloidal suspensions of metallic nanoparticles have all been more or less unsatisfying in the reproducibility issues and reliability of the results. More recently developed substrates through lithographic nanofabrication techniques suffer from complicated and time consuming production procedures requiring expensive equipments. At this point using a template-based approach seems to be the most efficient way of producing a good SERS substrate. In this dissertation we used a nanoporous template produced by the anodic oxidation of aluminium (AAO) in a suitable electrolyte under appropriate conditions. AAO templates are constituted of hexagonally arranged nanoporous structure with pore bottoms covered by an insulating barrier layer. The barrier layer hinders the electodeposition of metals into the template therefore should be removed by an additional method. We adapted a technologically long-known method, zincating, to the treatment of AAO templates by replacing the oxide at the pore bottoms by a thin zinc layer. This zinc layer besides making the electrical connection of the metallic base with the solution is also prohibiting the reoxidation of aluminium. Pore-bottom activated aluminium templates are subsequently used for the DC electrodeposition of metallic nanowires. Freestanding arrays of nickel, gold and silver nanowires are used as an illustration of the technique. Gold nanowire arrays are chosen as SERS substrates due to the plasmonic properties of gold under the desired excitation wavelengths. First the efficiency of the substrates was tested with the probe molecule Rhodamine 6G.The SERS sensitivity was xxi elucidated by the investigation and optimization of the aspect ratio-enhancement relationship. Following the identification of the ideal fabrication parameters for the highest SERS enhancement, the substrates were evaluated for biological molecule related SERS studies. To show the SERS functionality of the substrates for biological molecules, a bigger protein molecule, bovine serum albumin (BSA), was investigated. The results obtained here were compared to the literature data and the suitability of the templates was justified. The substrates did not caused any conformational changes and the secondary structure of the protein was successfully elucidated and compared to the literature data. Finally the substrates were used in the evaluation of the adsorption behaviour of a small genetically engineered peptide: gold binding peptide (GBP) under different surface charge conditions for the first time in literature. The results were interpreted both in terms of solution charge and peptide charge effects on the adsorption properties of GBP. The obtained data indicated that at pH 4.5 the peptide was adsorbed to the surface through its negatively charged carboxyl residues and an increase in its beta-sheet conformation was observed suggesting that the peptide placed itself horizontally to the gold surface. Other pH conditions gave also results conform to previous studies.