Saccharomyces Cerevısıae De Etanol Direncinin Moleküler Karakterizasyonu

Abstract

Şekerleri etanole hızlı ve etkili bir şekilde dönüştürme yeteneği, ve yüksek etanol konsantrasyonlarına dayanıklı olması sebebiyle, S. cerevisiae biyoteknolojideki öncü maya “hücre fabrikası”nı temsil eder ve dünyanın başlıca biyoteknolojik ürünü olan içilebilir ve endüstriyel etanol üretiminde en fazla kullanılan mikroorganizmadır. Fakat, S. cerevisiae mayası çok yüksek konsantrasyonlarda (14%, v/v) etanole karşı hassastır. Etanol, biyolojik membranlardan difüzyonla serbestçe geçerek hücre büyümesinin inhibisyonuna ve hücre canlılığının azalmasına, ayrıca etanol fermentasyon hızının ve son verimin düşmesine neden olmaktadır. Bu nedenlerden dolayı, biyokütleden biyoetanol üretimi için, yüksek konsantrasyonda etanole toleranslı suş eldesi arzu edilmektedir. Bunun için, S. cerevisiae’deki etanol stres tolerans mekanizmalarının anlaşılması oldukça önemlidir. Bu çalışmanın amacı, etanol stres direncinden sorumlu mekanizmalar hakkında; genetik, fizyolojik ve fenotipik unsur ve göstergelerin araştırılması ile daha geniş bilgiler elde etmektir. Önceki bir çalışmada etanole dirençli mutantlar, evrimsel mühendislik yönteminin sabit (%5 etanol, v/v) ve artan (% 5’den %11,4’e) stres uygulamaları kullanılarak elde edilmiştir. Daha sonra, artan stres uygulaması stratejisi ile elde edilen mutant bireyler başka endüstriyel streslere çapraz dirençleri açısından fenotipik olarak karakterize edilmişlerdir. Bu çalışmada, bu mutantlar mikrodizileme analizi ile transkriptomik olarak analiz edilmiştir. Transkriptomik analizlere paralel olarak büyüme eğrileri elde edilmiş; ayrıca glukoz, asetat, etanol ve gliserol gibi hücre dışı metabolitler ile glikojen, trehaloz gibi hücre içi metabolitlerin üretimi araştırılmıştır. Hücre dışı metabolit miktarları, yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) analizleri ile değerlendirilmiştir. Stres dirençleri, en muhtemel sayı (MPN) ve damlatma deneyleri ile belirlenmiştir. Bunun haricinde, etanole dirençli mutant kültürlerde mitokondriyal kusur görülme sıklığı araştırılmış ve bu mutant kültürlerin genetik olarak stabil olup olmadıkları incelenmiştir.

Because of its very high capability for rapid and efficient conversion of sugars into ethanol, and tolerance to high ethanol concentrations S. cerevisiae represents the primary yeast ‘cell factory’ in biotechnology and is the most exploited microorganism known, producing potable and industrial ethanol, which is the world’s premier biotechnological commodity. However, S. cerevisiae is sensitive to very high concentrations of ethanol (14%, v/v). Accumulation of ethanol incide the cell has remarkable adverse effects on cellular growth and viability. So, obtaining high ethanol-tolerant strain is desirable for bioethanol production from biomass. For this reason, understanding the ethanol stress tolerance mechanism in Saccharomyces cerevisiae is crucial. The aim of this study was to gain more insight into the mechanisms responsible for ethanol stress tolerance by investigating genetic, physiological and phenotypic components and indicators. In a previous study, ethanol resistant mutants were obtained via constant (5%, v/v ethanol) and increasing (5% to 11,4% ,v/v ethanol) stress application strategies of evolutionary engineering method. After that, individual mutants of increasing stress application strategy were characterized phenotypically in terms of their cross-resistance for other industrial stresses. In this study, these mutants were analyzed transcriptomically by microarray analysis. In parallel with transcriptomic analysis, growth curves were graphed and co-evaluated with extracellular metabolite levels regarding glucose, acetate, ethanol, glycerol and intracellular metabolite levels including glycogen and trehalose. Stress resistances were determined via Most Probable Number (MPN) method and spotting assay. Also, respiratory deficiency levels of these mutants were investigated, and genetic stability levels were determined.