donma-eri̇me Stresi̇ne Di̇rençli̇ Saccharomyces Cerevisiae Laboratuvar Ve Endüstri̇yel Suşlarinin Gen Anlatim Düzeyleri̇ndeki̇ Farkliliklarinin Qrt-pcr İ̇le Anali̇zi̇

Abstract

Bu çalışmanın amacı daha önce donma-erime stresine direnç kazandırılmış olan Saccharomyces cerevisiae laboratuvar ve endüstriyel suşlarının, kontrol ve donma erime stres koşullarında gen anlatım düzeylerindeki değişikliklerin Gerçek Zamanlı PCR (qRT-PCR) yöntemi ile belirlenmesidir. Gen anlatım düzeyi değişiklikleri, dirençli suşların gen anlatım değerleri referans suşlarınkine normalize edilerek belirlenmiştir. S.cerevisiae küçük, tek hücreli ve tomurcuklanan bir maya türüdür. Bu maya türü uzun yıllardır bilimsel çalışmalarda model organizma olarak kullanılmaktadır. Endüstrideki yaygın kullanımından ve tek hücreli basit ökaryotik yapısından dolayı en çok çalışılan model organizmalardan biri olmuştur. Kültürlenmesinin kolay olması ve ökaryotik bir organizma olmasından dolayı bitki ve hayvanların karmaşık hücre yapısını araştırmaya yönelik moleküler biyolojik çalışmalarda kullanımı yaygındır. Fermentasyon yapabilme yeteneğinden dolayı S.cerevisiae bira, şarap ve ekmek yapımında çok eski çağlardan beri kullanılmaktadır. Bu yaygın kullanım S. cerevisiae'yi ticari olarak önemli hale getirmiştir. Bu organizma son zamanlarda biyoetanol ve biyoyakıt üretiminde de kullanılmaktadır. S. cerevisiae hamur mayalayabilme yeteneğinden dolayı ekmek yapımında da kullanıldığı için, endüstriyel alanda ekmek mayası olarak adlandırılmakta ve kullanılmaktadır. Uzun süreli muhafazası için dondurulduğunda ise, hücrelerin donma-erime stresine maruz kaldığı bilinmektedir. Bu stres koşulu, oldukça karmaşık hücresel tepkilere yol açmaktadır. Bu çalışmada haploid S. cerevisiae'nin CEN.PK113-7D (MAT a) adlı laboratuvar suşu ve R625 adlı poliploid endüstriyel suşları ve bunlardan önceki çalışmalarda elde edilmiş olan donma-erime stresine dirençli mutant suşları F1 ve P8 kullanılmıştır. Önceki çalışmalarda bu mutant suşların elde edilmesinde öncelikle mutajenik bir ajan olan etil metan sülfonat (EMS) kullanılmış ve bu sayede donma-erime stresine dirençli bir başlangıç popülasyonu elde edilmiştir. EMS ile mutajenize edilmiş bu başlangıç popülasyonu ise tekrar eden donma-erime streslerine maruz bırakılmış ve fenotipik olarak donma erime stresine en dirençli suşlar olan F1 (laboratuvar suşu) ve P8 (endüstriyel suş) seçilmiştir. Donma-erime stresine dirençli mutant bireylerin genetik altyapısının anlaşılabilmesi amacıyla, F1adlı mutant laboratuvar suşunun tüm genom transkriptomik analizleri daha önceden yapılmış ve bu amaçla DNA mikroarray tekniği kullanılmıştır. Elde edilen mikroarray sonuçları GeneSpring GX 9.0 yazılımı kullanılarak analiz edilmiştir. F1 suşuna ait olan mikroarray verileri, bu yazılım ile yaban tipe normalize edilmiştir. Bu tez çalışması için ise mikroarray verilerinden yararlanılmış ve F1'de anlatımı en fazla artmış olan HSP12, FMP45, HSP26, HXK1 genleri ve anlatımı en fazla azalmış olan PHO84, NSR1, ZRT1 genleri çalışma için seçilmiştir. Donma erime stresi ile ilişkili olabileceği düşünülen bu genlerin bağıl transkripsiyon değişimleri F1 ve P8 de kontrol ve donma-erime stresi koşullarında çalışılmıştır. Bağıl transkripsiyon analizleri için qRT-PCR tekniği kullanılmıştır. S. cerevisiae hücreleri -80º C'den alınıp 30ºC'de kültürlendikten sonra kültürün OD600 değerinin 1'e ulaşması beklenmiş ve ardından RNA izolasyonu yapılmıştır. RNA izolasyonunun ardından cDNA sentezlenmiş ve gerçek zamanlı PCR yöntemi uygulanmıştır. Uygulanan gerçek zamanlı PCR yönteminde ise 'SYBR Green' boyası kullanılmıştır. Özet olarak, çalışmada haploid laboratuvar suşu '905've onun-donma erime stresine dirençli mutant suşu 'F1', endüstriyel suş R625 ve onun donma erime stresine dirençli mutant suşu 'P8' kullanılmıştır. Donma erime stresine direnç fenotipinin altında yatan genetik faktörlerin araştırılması amacıyla HSP12, FMP45, HSP26, HXK1 PHO84, NSR1 ve ZRT1 genlerinin transkriptomik analizleri yapılmıştır. Analizler hem kontrol hem de stres koşulları için ayrı ayrı gerçekleştirilmiştir. Yapılan analizler, laboratuvar suşunda ve endüstriyel suşta aynı genler için gen anlatım seviyelerinin farklı olabileceğini göstermiştir. Ayrıca, farklı zamanlarda fakat aynı koşullarda belirlenen gen anlatım seviyelerinin mikroarray ve qRT-PCR'da farklı olabileceği görülmüştür. Elde edilen sonuçlar, incelenen genlerde laboratuvar suşu ile endüstriyel suş arasında anlatım düzeyi farklılıkları olabildiğini göstermiştir. Bu durumun endüstriyel S.cerevisiae suşlarının poliploid olmasından kaynaklanabileceği düşünülmektedir. Aynı zamanda sonuçlar, F1 suşuna ait mikroarray ve qRT-PCR anlatım düzeyi değerlerinde de farklılıklar olabileceğini göstermiştir. Bu durum da iki farklı analiz yöntemi arasında qRT-PCR lehine bir hassasiyet farkı olmasıyla açıklanabilir.

The aim of this thesis study was to analyze gene expression level differences between freeze-tolerant laboratory and industrial strains of Saccharomyces cerevisiae, to gain insight into the molecular mechanisms of freeze tolerance in this yeast. For this purpose, S. cerevisiae laboratory strain '905', industrial strain 'R625' and their freeze-thaw resistant mutant individuals 'F1' and 'P8' were used. Freeze-thaw stress-related genes were chosen according to whole-genome transcriptomic analysis results of 905 and F1, which have been obtained previously. S.cerevisiae is a small, unicellular fungus that has been used as a model eukaryotic organism in biological research for a long time. Also, it has been commonly used in industrial processes since ancient times. The ability to ferment sugars makes the budding yeast is commercially important in bread-making and wine industries. The organism is also being used in bioethanol and fuel ethanol production, recently. S. cerevisiae is also named as baker's yeast because of its ability to leaven dough. It is also known that the yeast cells are exposed to freeze-thaw stress during long term storage conditions. Thus, cryopreservation process is a stressful condition for yeast cells. The freeze-thaw resistant mutants F1 and P8 were obtained in a previous study by an inverse metabolic engineering approach, based on random mutation and selection under freeze-thaw stress conditions. Whole-genome transcriptomic analyses of 905 and F1 were also done previously. To verify the transcriptomic analysis results obtained by DNA microarray technique, gene expression levels of selected genes were determined by Quantitative RT- PCR. The genes were selected from microarray data according to their high up- or downregulation levels. Highy upregulated genes HSP12, FMP45, HSP26, HXK1 and highly downregulated genes PHO84, NSR1, ZRT1 were chosen for gene expression analysis by qRT-PCR. The qRT-PCR experiments were performed under control and stress conditions for '905', 'F1' 'R625' and 'P8' strains. The expression profile of 'F1' was normalized to that of the wild type laboratory strain '905', and the expression profile of 'P8' was normalized to that of the wild type industrial strain 'R625'. In conclusion, it was found that freeze-thaw stress causes significant changes in gene expression patterns of both laboratory and industrial strains. In addition, some differences were also found between gene expression level results of microarray and qRT-PCR analyses. This indicates the importance of verifying DNA microarray results by qRT-PCR, as qRT-PCR is a more sensitive method.