Farklı Prıon Proteini Varyantlarının Yanlış Katlanma Mekanizmalarının Moleküler Dinamik Simülasyonları İle Araştırılması

Abstract

Bulaşıcı süngerimsi ensefalopatiler (TSE) ölümcül nörodejeneratif hastalıklardır. İnsanda; Creutzfeldt Jakob hastalığı (CJD), Fatal Familial İnsomnia (FFI), hayvanlarda; Bovine Spongiform Encephalopathy (BSE), skrapi, Transmissible Mink Encephalopathy (TME) gibi hastalıklara prion adı verilen bir proteinin yanlış katlanması neden olur. Creutzfeldt Jakob Disease (CJD): Tedavi edilmeyen ölümcül bir hastalıktır. Kendini bunama, hafıza kaybı, halüsinasyonlar ve anksiyete ile gösterir. Deli dana olarak bilinen Bovine Spongiform Encephalopathy’nin insanlardaki formudur. Fatal Familial Insomnia (FFI): Dünyada 40 ailede bulunan bir hastalıktır. Hastalar uyuyamama, hızlı kilo kaybının yanı sıra halüsinasyon ve bunama gösterir, hastayı ölüme doğru götürür. Gerstmann- Straussler-Scheinker sendromu çok az görülen bir hastalıktır. Konuşma zorluğu, cerebellar ataksi ve bunama gibi semptomları vardır. Bovine Spongiform Encephalopathy (BSE): İneklerde gözüken ve CJD’nin oluşumuna neden olan formdur. İlerleyici semptomlar öncelikle davranışsal olarak sonra nörolojik olarak kendini gösterir. En önemli semptomlardan biri ışığa, dokunmaya ve sese karşı duyarlılığın ve tepkinin artması ile ataksi meydana gelir. Enfekte hayvanlar hastalığın son aşamasında ayakta duramaz hale gelirler. Transmissible Mink Encephalopahty (TME): Faralerde görülen formudur. Önceklikle şaşkınlık, temizlik alışkanlığının kaybedilmesi, amaçsızca etrafında dönme gibi davranışsal değişiklikler gözlemlenir. Sürekli uyuklama durumu, ağırlaşma hali ve tepkisizlik hasatlığın son safhasında dikkat çeker. Skrapi: Koyun ve keçilerde görülen paraliz ve ölümle sonuçlanan TSE formudur. Hastalığın başlangıcında aşırı telaş, sinirlilik, agresiv hareketler, sese karşı aşırı hassasiyet görülür. Kaşınma, tüy dökülmesi, uyuşukluk, düşünme ve davranışlarda belirgin yavaşlama hali,hipermetri gibi klinik bulguları en son aşamada ayağa kalkamama, pareliz, genel kas titremeleri takip eder. En yaygın TSE’lerden biri Skrapi’dir. Skrapi ilk olarak İngiltere’de rapor edilmiş ve sonrasında Fransa, Almanya Polonya ve Avrupa’nın genelinde görülmüş sonra bütün dünyaya yayılmıştır. 2014’ün ikinci yarısında alınan raporlara göre Avrupa’da yaygın olarak bulunmaktadır. Hastalığın ilk evrelerinde davranışsal bozukluklar gözlemlenir. Klinik bulgular hastalığın son safhasında kendini gösterdiği için hastalığın tanısı geç olmaktadır. TSE’ler hayvanlardan insanlara geçebildiği için toplum sağlığını tehdit etmekte, hayvancılığı ise ekonomik olarak etkilemektedir. Bulaşma çevredeki uzun yıllar yaşayan etkenin alınması ile, yeme içme ile, anneden yavrusuna plasenta ile alınabilir. Bu hastalıkları oluşturan infeksiyöz etken bakteri ya da virus değildir. Normalde hücre yüzeyinde bulunan bir proteinin yanlış katlanması ile oluşmaktadır. Yaklaşık 250 kalıntıdan oluşan bu protein PRNP adı verilen bir gen tarafından kodlanmaktadır. İlk 22 kalıntı sinyal sekansını içermektedir. Bunu şekilsiz, glisin bakımından zengin olan, Cu2+ bağlayan N-ucu takip etmektedir. C-ucu 121-231 rezidülerini içerir. Bu bölge düzenlidir; üç sarmal ve iki β-ipliğinden oluşmaktadır. Doğru katlanmış protein (PrPc) α-sarmal bakımından zengindir. Düzenli kısmı % 45 oranında sarmal, %3-8 β-yaprağı yapısındadır. Yanlış katlanma sonucu oluşan proteinin (PrPSc) α-sarmal içeriği azalır ve çoğunlukla β-yapraklarından (neredeyse %50 oranında) oluşur. PrPc’nin PrPSc ile karşılaşması yanlış katlanmayı katalize eder. Böylece hastalık ilerler ve hastalıklı bir canlının proteininin diğer canlıya geçmesi ile hastalık bulaşır. PrPSc’ler oligomerler ya da fibriller oluşturabilirler. Oluşan bu fibriller doku ve organlarda ölüm sonrası görülen plakları oluşturur. Beyinde ise süngerimsi boşluklu yapıların oluşmasına neden olduğu için ismi ‘süngerimsi’ olarak adlandırılmaktadır. Literatür hastalık yapan bölgenin neresi olduğuna dair tartışmalıdır. Bir kısım araştırmacılar hastalığı C terminustaki yanlış katlanmadan dolayı meydana geldiğini kabul etse de N terminustaki rezidülerin yanlış katlanmasıyla oluştuğunu düşünenler de vardır. Yanlış katlanmış yapı ve buna giden yollar bilinmemektedir. Ağırlıklı olarak kabul gören kısım C terminustaki sarmal 2 (H2) ve sarmal 3’ün (H3) yanlış katlanarak β-yaprağı oluşturmasıdır. Birden fazla yanlış katlanmış yapı ve buna giden farklı yolların olması da mümkündür. Ancak yine de tam olarak yanlış katlanmış üç boyutlu yapı bilinmemekte ve bu konu araştırmaya ihtiyaç duymaktadır. Bu çalışmada moleküler dinamik simulasyonları ile bu yanlış katlanmaya giden yolların aydınlatılmasına katkıda bulunulacaktır. En yaygın TSE türlerinden biri olan skrapide 136, 154 ve 171. rezidülerin hastalık oluşumunda önemli olduğu bulunmaktadır. Bu çalışmada üç varyant ele alınmıştır. Bunlardan biri düşük dirençli olduğu bilinen yabanıl tiptir (ARQ: A136, R154, Q171). Diğer ikisi, en dirençsiz mutant (VRQ: V136, R154, Q171) ve en dirençli mutanttır (ARR: A136, R154, R171). Bu üç varyant birbirinden 136. ve 171. konumdaki rezidüler ile ayrılmaktadır. Simulasyonlar Amber ff10 kuvvet alanı ve generalized Born sürekli ortam çözücü yöntemi ile 310 ve 330 K sıcaklıklarda gerçekleştrildi. Simulasyon süreleri 400 - 700 ns’dir. 310 K’deki her üç simulasyonda da proteinin hareketli bölgeleri (terminaller hariç) şunlardır: 1) Sarmal 1 ve sarmal 1 ile β-ipliği 1 arasındaki döngü (kalıntı 135-149); 2) β-iplik 2 ile α-sarmal 2 arasındaki döngü (168-177); 3) α-sarmal 2’nin C ucu ve sarmal 2 ile 3 arasındaki döngüdür (186-204). 168-177 numaralı rezidülerinin arasındaki bölgenin hareketi her üç varyantta da benzerdir. Diğer iki bölgedeki hareketliliklerin miktarı ve yönü her üç varyantta farklı bulunmuştur. En dirençli olan ARR, diğer yapılardan daha durağandır. En dirençsiz olan VRQ’da hareketlilik en yüksektir. Dolayısıyla hareketlilik ile direnç arasında bağıntı görülmektedir. Bu varyantta özellikle sarmal 1 sarmal 3’e göre konumunu büyük oranda değiştirmektedir. Diğer iki varyantta ise kristaldeki konumundan çok uzak olmayan bir yerde kalmaktadır. Dolayısıyla sarmal 1’in hareketi 136. konumdaki valinden kaynaklandığı gözükmektedir. Diğer iki varyantta burada alanin (A) yer almaktadır. Konformasyon değişimlerini hızlandırmak için 330 K’de yapılan ek simulasyonlarda tüm varyantlarda heliks 1’in konumunu değiştirdiği görülmüştür. VRQ’da buna ek olarak kristalde görülen beta yaprağı da bozulmuştur. Bu sonuçlar sarmal 1’in açılmasının ardından sarmal 2 ve 3’ün β-yaprağına dönüşeceğini öngören ‘Banana peeling’ modeli ile uyumludur.

Transmissible Spongiform Encephalopathies(TSE) are fatal neurodegenerative diseases. Examples are: bovine spongiform encephalopathy (BSE) in cow, scrapie in sheep and Creutzfeldt Jakob disease (CJD) in humans. A misfolded version of a protein named prion causes these diseases. Properly folded protein(PrPC) is rich of α-helix. The misfolded protein (PrPSc) contains less α-helix and is mostly comprised of β-sheets. Encounter of PrPC and PrPSc catalyzes the misfolding and disease propagation. The disease is transferred between individuals via transfer of these proteins. PrPSc can create oligomers or fibrils. The N-terminus of this protein is disordered and it is believed that it binds Cu2+. The ordered part at the C-terminus is comprised of 3 α-helices and 2 β-strands in the correctly folded state. In the literature, the part of the protein which causes the disease is controversial. Also, the misfolded shape and misfoling pathways are unknown. The predominantly accepted idea is that helices 2 and 3 (H2 and H3) at the C-terminus create a β-sheet by misfolding. Existance of more than one misfolded shape and pathway is also possible. However, the 3-dimensional PrPSc shape is still unknown and there is a need for researches on this subject. This study will contribute to enlighting of these misfolding pathways by using molecular dynamic simulations. One of the most common form of TSE is scrapie. For scrapie development, the 136th, 154th and 171st residues are important. This study focuses on 3 variants. First of these variants is weakly resistant wild type (ARQ: A136, R154, Q171), the second one is the most susceptible mutant (VRQ: V136, R154, Q171) and the other one is the most resistant mutant (ARR: A136, R154, R171). Simulations have been made with generalized Born continuum solvation method and Amber ff10 force field at 310 and 330 Kelvin. Simulation durations are 400-700ns. Fluctuated regions (except termini) of the proteins in all 3 simulations at 310K are: 1) H1 and the loop between H1 and β-strand 1(residues 135-149); 2) the loop between β-strand 2 and H2 (residues 168-177); 3) C-terminus of H2 and the loop between H2 and H3 (residues 186-204). Movement of the region between 168-177 is similiar in all 3 variants. In the other two regions, the magnitude and direction of the movements are found to be different in all 3 variants. ARR which is the most resistant variant has the lowest mobility. VRQ, the most susceptible variant, is the most mobile variant in the simulations. Therefore, it is seen that there is a relation between susceptibility and mobility. Especially, in VRQ, H1 is relocated with respect to H3. Position of H1 in the other two variants (ARR, ARQ) is not too far from crystal structures. Hence it is seen that valine as the 136th residue has an effect regarding the reposition of H1. The other two variants have alanine instead of valine as the 136th residue. In order to accelerate the conformational changes, simulations have been performed at 330 K and H1 has changed its position in all these simulations, including ARR and ARQ. In addition, VRQ has deformed its β-sheet in the 330 K simulations. These results are compatible with the ‘banana peeling model’ which suggests that relocation of H1 is necessary for the conversion of H2 and H3 to β-sheet.