Evrimsel Mühendislik İle Elde Edilmiş Bor Stresine Dirençli Mutant Mayanın Moleküler Karakterizasyonu

Abstract

Bor ve bileşik yapıları uzun zamandan beri bilinmesine rağmen teknolojideki yaygın kullanımı son zamanlarda yeni yeni artmıştır. Çevresel açıdan bulunurluğu zor olmasa da, maden rezervlerinin eşit dağılmadığı görülmektedir. Türkiye de bor madenleri açısından en zengin ülkelerden biridir. Yeryüzündeki yaşam formunun oluşumunda borun etkin rol aldığı düşünülmektedir. Bor elementi birçok organik bileşiğin yapısında yer almaktadır. Bu organik bileşikler, elektrofilik açıdan oldukça güçlüdür ve bunların en iyi bilinen fizyolojik formu borik asittir. Borik asit aynı yönde yerleşmiş hidroksil ve bazı amino gruplarını başlama kapasitesine sahiptir. Daha çok enzimlerin aktif bölgesinde ve 5 karbonlu ve furanoz halkası içeren karbonhidratlarda bulunan gruplarla bağ yaparlar. S-adenozil metyonin, nikotinamid adenin dinükleotidler, adenozin fosfatlar, diadenozin fosfat ailesi üyeleri ve RNA’ların 3 uçları gibi metabolizmada önemli moleküllerin ribozları borik asitle etkileşmeye açıktır. Bor birçok bitki, hayvan ve mikroorganizmanın yapısına katılan önemli bir elementtir. Lakin her canlının denge sistemine dayanan yaşamsal aralığı yüksek miktarda bor elementinin toksik olarak algılar ve zarar görür. Toksisite mekanizması ve bor stres yanıtının organizmalardaki bileşenleri henüz açıklığa kavuşmamıştır. Bor direncinin moleküler mekanizması yönünde literatürde çok az bilgi bulunmakta ve mevcut bilgilerin çoğu son birkaç yılda yayınlanmış uluslararası makalelere dayanmaktadır. Bu nedenle bu konu, incelenmesi gereken güncel bir araştırma konusu olup, bu çalışmalar sonunda belirlenebilecek, bor direncine neden olan ve/veya bora bağlanabilen proteinlerin analizi ve bunların yapılarında meydana getirilebilecek değişiklikler ile borun kullanıldığı pek çok endüstriyel uygulamalarda biyobenzetim ve nanobiyoteknoloji yaklaşımı ile bu proteinler ve/veya yapıca onlara benzeyen hibrit moleküller kullanılarak proses verimleri arttırılabilir konuma gelecektir. Bu mekanizmaların deneysel olarak aydınlatılması ve anlaşılması model bir organizma kullanımını zorunlu kıllar. S. cerevisiae mayası, bu amaca hizmet edebilecek genetik niteliklere ve denenmişliğe sahip olmasının yanında bor stresi çalışmaları için uygun özelliklere sahip bir model organizmadır. S. cerevisiae ökaryotik ve tek hücreli bir canlıdır. Bu özelikleri sayesinde genetik açıdan kolay manipüle edilebilirlik sağlarken, aynı zamanda diğer tüm ökaryotları temsil ederek onlar hakkında bilgi edinebilmek için model olmaktadır. Bu çalışmada model organizma olarak S. cerevisiae kullanılmıştır. Bu deneyde yaban tip S. cerevisiae dışında, evrimsel mühendislik yöntemiyle daha önce elde edilmiş olan bora dirençli mutantın fizyolojik ve moleküler karakterizasyonu yapılmıştır. Evrimsel müdendislik yönteminde hücreler başlangıç kültüründe kimyasal veya fiziksel yolla mutasyona ugratılırlar. Ardından, mutasyona uğradığı düşünülen hücre popülasyonu sürekli ve giderek artan stres faktörüne maruz bırakılır. Sürekli artan stres ile popülasyon içinden istenilen stres koşuluna dayanıklı bireylerin seleksiyonu sağlanmış olur. Bu deneyde stres faktörü olarak bor kullanılmıştır. En yüksek miktarda bor elementini tolere edebilen bireyler arasından en iyi bireyi seçmek için bor stresine ve yapılan çapraz direnç testlerine en fazla dayanan birey deneylerde kullanılacak mutant olarak seçilmiştir. Çapraz direnç testi; bireylerin ağır metaller, yüksek tuz, yüksek etanol gibi farklı stres koşullarına verdiği tepkiler, üreme durumlarını görmeye yarayan testlerdir. Seçilen en iyi birey bor direnç mekanizmasında yabanıl tip ile karşılaştırmalı olarak incelenmiştir. Fenotipik analizler için katı besiyeri ortamına ekimler yapılarak mutant bireyin çapraz direnç mekanizmaları belirlenmiştir. Bu çalışma için farklı konsantrasyonda bor ve farklı stres koşullarına sahip (metal, iyon ve farklı bileşikler) katı besiyerleri hazırlanarak yabanıl tip ve mutant bireyin büyümeleri ve sonuçları gözlenmiştir. Mutant birey ve yabanıl tip bor stresinin olduğu ve olmadığı sıvı kültürde üretilmiştir. Üreme sırasında üretilen ve tüketilen metabolitler HPLC (Yüksek Basınçlı Sıvı Kromotografi) ile ölçülmüştür. Hem mutant hem yaban tipin farklı üreme koşullarında ve farklı zamanlarda, besi yerindeki glikoz tüketimi, maltoz, etanol, gliserol ve asetat üretimi belirlenmiştir. Böylelikle farklı zaman dilimlerinde iki suşta oluşan üretim ve tüketim farklılıklarına göre karşılaştırma yapılmıştır. Ayrıca, enzimatik yöntemlerle hücrede oluşturulan trehaloz ve glikojen konsantrasyonları ölçülmüştür. Trehaloz ve glikojen S. cerevisiae’de stres durumunda üretilen metabolitlerdir. Trehaloz bir disakkarit, glikojen ise polisakkarittir. Hücrede rolü açık olarak bilinmemesine karşın, açlık ve stres durumuna karşı hücrenin depoladığı besin kaynakları olarak bilinir. Bunun yanında protein ve hücre membranı yıkımına karşı şaperonlar gibi işlev gördüğü de bilinmektedir. Bu sebeplerden ötürü mutantın ve yaban tipin trehaloz ve glikojen üretim seviyeleri belirlenmiş ve karşılaştırılmıştır. Aynı zamanda HPLC ile trehaloz ve glikojen deneylerinde suşlara bor stresi uygulanmış ve sonuçta stress faktörünün de bu metabolitlerin üretimi üzerindeki etkisi de gözlenmiş ve karşılaştırılmıştır. Mutant birey ve yaban tipin moleküler karakterizasyonu için gen ekspresyon düzeyleri incelenmiş ve bu analiz için qPCR (quantitative PCR) ve mikroarray metotları kullanılmıştır. Yaban tipin ve mutantın, hem stresli koşulda hem de kontrol koşulunda, literatürde bor mekanizmasıyla ilişkili oldukları tespit edilen BOR1, ATR1 ve DUR3 genlerinin ekspresyon düzeyleri belirlenip kıyaslanmıştır. BOR1 geninin bor elementinin hücre dışına çıkarılmasında efektif görev alan Bor1p zar proteinini kodladığı bilinmektedir. İlk defa bitki kök hücrelerinde AtBOR1 homoloğu olarak bulunan bu protein bor sıkıntısı çeken bitkilerin kök hücrelerine bor depolamasını sağlamakla birlikte ihtiyaç halinde köklerden yapraklara doğru bor taşınması için depo hücrelerinden borun atılmasında görev alan bir proteindir. Son yıllarda keşfedilen ATR1 geninin ise BOR1 ile benzer olarak hücre dışına bor atımı yaptığı belirlenmiştir, ancak Atr1 zar protein hücre için toksik düzeye ulaşan bor miktarı azaltmak için boru dışarı atmaktadır. DUR3 ise hücre içindeki bor ihtiyacını karşılamak için içeriye bor alımında görev alan Dur3p proteinin kodlar. Bu bilgiler doğrultusunda bor stresine dirençli mutant mayada bu genlerin ekspresyon düzeyleri incelenmiştir. Tüm genom analizi yapılarak hangi yolakların stres sebebi ile nasıl değiştiği gözlemlenmiştir. Bu amaç doğrultusunda gen ekspresyon analizi için mikroarray yapılmıştır. Yaban tip ve mutantın tüm genom ekspresyon düzeyleri karşılaştırılmıştır. Mutantta ekspresyonu artan ve azalan genler belirlenmiş ve bu genlerin hangi yolaklarda işlev gördüğü araştırılmıştır. Bu sayede organizmadaki bütün genlerin transkripsiyon seviyeleri belirlenerek, organizmanın bor stresi durumunda hayatta kalmasını sağlayan yolaklar aydınlatılmıştır. Elde edilen bu sonuçların, önceki deneylerde açığa çıkarılan fizyolojik ve fenotipik sonuçlar ile desteklendiği gösterilmiştir. Mikroarray analizi sonuçları stres ortamında mutant bireyin enerji yolaklarını önemli ölçüde aktive ederek enerji üretiğini ortaya koymuştur. Ayrıca, mutantta, yüksek düzeyde enerji tüketimi gerektiren metabolik yolaklakların inaktif olduğu görülmüştür. Transkripsiyon ve protein sentezi bu yolaklardandır. Özellikle, S. cerevisiae’de strese karşı direnç açısından önemli rol oynayan trehaloz ve glikojenin üretiminde rol oynayan genlerin ekspresyon düzeylerinde önemli ölçüde artış gözlenmiştir. Bu sonuçların ışığında bora dirençli mutant bireyde detaylı genetik ve proteom çalışmalarına devam edilmesi bor direnç mekanizmasının aydınlatılması açısından önem taşımaktadır.

Boron is an essential micronutrient for plants and it is either necessary or beneficial for animals as an ultra trace element. It is also a growth supplement for Saccharomyces cerevisiae; however, increasing levels of boron (up to 80 mM) inhibit its growth. The essentiality, utilization and toxicity of boron in living organisms are not fully understood yet. To date in the literature, three genes have been reported to be related to boron resistance in S.cerevisiae; BOR1, ATR1 and DUR3. BOR1 encodes a protein that is localized in the yeast plasma membrane. Moreover, Bor1p exports excess boron out of the cell to maintain ionic homeostasis inside the cell. The other gene, ATR1 which was identified later, plays a major role to export boron out of the cell, when it is upregulated by high levels of boron. On the contrary, Dur3 transporter protein has a role against the efflux transporters Bor1 and Atr1. Although its functions are not clear, overexpression of DUR3 increased boron levels inside the cells. In this thesis work, the approach was to generate S.cerevisiae mutants with high boron resistance by using evolutionary engineering strategy that was previously applied successfully. Boron-resistant S.cerevisiae mutants were obtained and their phenotypic and physiological characteristics were determined. In order to identify the molecular mechanisms implicated in boron resistance, the whole transcriptomes of wild type and one of the most resistant mutants were compared via microarray analysis. Besides, BOR1, ATR1 and DUR3 expression profiles were also analysed by quantitative RT-PCR.