Corıolopsıs Polyzona Tarafından Üretilen Lakkaz Enziminin Saflaştırılması Ve Karakterizasyonu

Abstract

Lakkazlar birden fazla bakır taşıyan oksidaz ailesinin içinde yer almakta ve mavi bakır içeren proteinler arasında en yaygın olarak bulunmaktadır. Polimerik lignin, aromatik amin ve benzentiyol gibi birçok bileşiğin yükseltgenmesini katalizlerler. Lakkaz enzimleri tarafından gerçekleştirilen fenolik bileşiklerin yükseltgenmesi ve moleküler oksijenin suya indirgenmesi reaksiyonları bu enzimin yoğun olarak çalışılmasını sağlamıştır. Lakkazlar yüksek bitkiler, bakteriler ve mantarlar tarafından üretilmektedir. Mantarlar tarafından üretilen lakkazların kağıt hamuru endüstrisi, tekstil boyalarının renksizleştirilmesi ve zehirinin giderimi, atık zehirlerinin giderimi ve biyolojik arıtma gibi birçok alanda uygulamaları bulunmaktadır. Mantarlar arasında beyaz çürükçül küf mantarları lakkazların en önemli üreticileridir. Bu çalışmada, beyaz çürükçül küf mantarı olan Coriolopsis polyzona MUCL 38443 lakkaz üretimi için yetiştirilmiştir. 50g/l glikoz, 17 g/l bakteriyolojik pepton, 2.5 g/l KH2PO4, 1.027 g/l MgSO4.7H2O, 0.03127 g/l CuSO4.5H2O, 0.0559 g/l MnSO4.H2O, 10 mg/l Tiamin–HCl içeren besiyeri C. polyzona’ dan yüksek miktarlarda lakkaz üretimini sağlamıştır. Enzim aktivitesi en yüksek değerine ulaştığında, organizma uzaklaştırılmış ve enzimi içeren sıvı ultrafiltrasyon tekniği ile homojen bir hale getirilmiştir. Saflaştırma protokolü iki farklı kolonun kullanıldığı anyon değişim kromatografisi ile hidrofobik etkileşim kromatografisinden oluşmaktadır. Lakkazın moleküler ağırlığı SDS-PAGE analizi ile hesaplanmış olup, aktivite tayini Native-PAGE analizi ile belirlenmiştir. Saflaştırılan lakkaz enzim aktivitesi üzerinde pH, sıcaklık, substrat ve inhibitor maddelerin etkileri incelenmiştir. Ayrıca saflaştırılmış lakkaz enziminin kinetik özellikleri, dalga boyu ve N-bölgesinde yer alan aminoasitlerin tayini yapılmıştır.

Laccases are included in multicopper oxidase family and the mostly distributed of all the blue copper-containing proteins. They catalyze the oxidation of a wide variety of compounds including polymeric lignin, aromatic amines, benzenthiols. Oxidation of phenolic compounds and reduction of molecular oxygen to water by laccases have led to intensive study of them. Laccases are produced by a wide range of higher plants, bacteria and fungi. Fungal laccases have a large variety of applications, such as pulp delignification, textile dye decolorization-detoxification, effluent detoxification, and bioremediation. Among fungi, white-rot fungi are the most important producers of laccases. In this study, white-rot fungus Coriolopsis polyzona MUCL 38443 was cultured for laccase production. A medium containing 50g/l glucose, 17 g/l bacteriological peptone, 2.5 g/l KH2PO4, 1.027 g/l MgSO4.7H2O, 0.03127 g/l CuSO4.5H2O, 0.0559 g/l MnSO4.H2O, 10 mg/l Thiamine–HCl supported high levels of laccase production by C. polyzona. When the enzyme activity reached to a maximum value, fungal mycelia were removed and the supernatant was purified to homogeneity by ultrafiltration. The purification protocol consisted of anion exchange chromatography with two different columns and hydrophobic interaction chromatography. The molecular weight of laccase was estimated by SDS-PAGE analysis and activity staining was determined by Native-PAGE analysis. Effects of pH, temperature, substrates and inhibitors on the activity of the purified laccase were further studied. Kinetic properties, spectrum analysis, and N-terminal aminoacid sequences were done for the purified enzyme.