Development and structural determination of antiangiogenic recombinant antibody structures for cancer treatment

Abstract

Vascular endothelial growth factor (VEGF) is a signaling molecule that plays a role in both vasculogenesis and angiogenesis. VEGFR-2/KDR (vascular endothelial growth factor receptor 2/ kinase insert domain receptor) is a tyrosine kinase that regulates a variety of angiogenesis-related cell responses. VEGFR-2/KDR is located on the surface of tumor cells and is heavily expressed in tumor-associated endothelial cells, where it modulates tumor-promoting angiogenesis. The suppression of VEGFR-2, which inhibits the angiogenic pathway in carcinogenesis, is thought to be a viable therapeutic method for the prevention and control of solid tumor growth. There are currently antibody (Ab) therapeutics targeting VEGFR-2 to treat cancer cells, but none of them is a final cure. Expectedly, the production of a novel effective anti-VEGFR-2 Abs would support cancer patients. The advancement of recombinant antibody technology and their tailored fragments has resulted in the emergence of a diverse array of antibody molecules, including the antigen binding fragment (Fab), the variable fragment (Fv), and the single chain variable fragment (scFv). Compared to the large size of a full antibody, scFvs have greater tissue penetration, decreased immunogenicity due to small molecular masses and accelerated clearance time. However, there are also some drawbacks of production of scFv structure which has poor biophysical properties, such as increased aggregation tendency and decreased thermodynamic stability, resulting in low performance and application. Protein solubility is critical in the synthesis and administration of therapeutic proteins. Inadequate solubility can lead protein aggregation, a detrimental phenomenon that can occur at any stage of recombinant protein synthesis. Numerous methods, extending from culture conditions to solubility enhancer tags, are being used to increase soluble expression. While fusing proteins to mostly soluble companions or expression with molecular chaperones may increase their total solubility, these techniques typically impair the proteins biological activity. There is no universal solution or technique for protein aggregation. anti-KDR 1.3 and anti-KDR 2.6 (anti-VEGFR-2) scFv molecules were formerly developed by phage display technique by TUBITAK MAM GMBE Immunogenetics Laboratory group. However, these antibodies are produced in inclusion bodies and form protein aggregates. Additionally, folding these molecules into active biological molecules is a laborious and uncertain process. Additionally, the protein yields are usually poor. The aim of this thesis is to address the expression and solubility problem of anti-KDR scFV molecules and to confirm the anti-angiogenic activities of the produced target molecules. In this manner, two different approaches have been adopted in the thesis, the first is the production and control of the target scFv molecules in mammalian cells, and the second approach is to transfer the target scFv molecules to a different structure using the complementarity determining regions CDR-grafting method, ensuring their production in bacteria and controlling their activity. In the first approach, the target scFv protein expression in mammalian cell culture was investigated. The existing scFv genes were utilized in the research. Different signal peptides were used for the construction of the plasmids including the target genes. Simultaneously, codon optimizations for the target cell line based on the target genes were performed. For this study, newly developed scFv genes were cloned into different mammalian expression vectors and transferred into competent cells by chemical transformation. Then, the cloned vectors were determined by colony polymerase chain reaction ( PCR) studies. The DNA sequences of the newly cloned scFv constructs were controlled by a capillary electrophoresis system. With the results obtained, sequence analysis was performed, and the proper incorporation of the gene into the plasmid, as well as the presence of mutations, were examined. The sequence of the target genest obtained were translated using bioinformatics tools, and the protein to be generated was examined for frameshifts. In accordance with these findings, the resulting vectors were purified and transfected into mammalian cells. New scFv constructs were produced in mammalian cells and purification was made by using chromatography columns. Transient transfections with vectors encoding the regulated target genes were initially conducted in different mammalian cell lines. Then, stable transfections were generated using the optimum antibiotic concentrations. The serial dilution technique was used to produce monoclonal cells from stably transfected cells. Chinese Hamster Ovary (CHO-K1) cells were adapted and suspended in serum-free media. Several feeding strategies, temperature experiments, and high volume production experimets were carried out in the cell culture studies. The resulting antibody structures were analyzed by SDS-PAGE and western blot methods. The binding of the samples to VEGFR-2 were then be checked by ELISA assays. After production and purification of the proteins, the activity and structure analysis were performed. Purified antibodies were examined by chromatographic methods based on HPLC (High Performance Liquid Chromatography). Real-time PCR method was used to investigate the presence of m-RNA in cells. In addition to these studies, Hydrogen Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) studies were carried out to reveal the structural dynamics of the anti-KDR 1.3 protein obtained from bacteria. Unfortunately, it was not possible to achieve better expression efficiency for the target anti-KDR molecules in mammalian cells. Overall results for poor expression or none were confirmed by monoclonal cells experiments, fed-batch experiments, codon optimizations, signal peptide alternatives. The selection of high-product yielding clones was requiring significant amount of time and effort in the development of cells producing recombinant molecules. As a result, the second half of this thesis focused on developing a unique technique for the quick and simple increase in solubility and production of the target proteins. In the second approach, a CDR grafting technique was used to modify and upgrade the structure of the existing scFv with a more producible pre-existing scFv to improve the biophysical characteristics of these scFv molecules. The effect of the CDR grafting technique on the solubility and efficacy of the expressed protein was investigated in this study. Computational methods were used to model our antibody structure and physicochemical properties, followed by experimental confirmation. CDR grafting technique was employed to modify and upgrade the structure of our scFv with a more producible pre-existing scFv. We used computational methods to model our antibody structure and its physicochemical properties, followed by experimental confirmation. Soluble expression analysis, affinity determination by surface plasmon resonance (SPR), in vitro activity assays were performed. According to the computational data, CDR grafting enhanced the solubility of the grafted scFv protein in comparison to the native scFv protein. SDS-PAGE and western blot analysis showed the expressed protein's increased solubility. SPR analysis revealed that the grafted molecule exhibits comparable binding affinities to the VEGFR-2 receptor to the native molecule. Biological activity studies, including proliferation inhibition, migration and wound healing experiments studies on human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), demonstrated that the newly synthesized grafted scFv protein posseses anti-angiogenic characteristics. This study reveals that a soluble scFv can be created by grafting the variable regions from an intrinsically insoluble scFv onto constant sections derived from innately soluble molecule. The drug potency of a low yield anti-angiogenic scFv (anti-KDR 1.3) with inclusion body formation tendency was highly increased by employing CDR grafting strategy.

Vasküler endotelyal büyüme faktörü reseptörü 2 (VEGFR-2/KDR) temel olarak endotel hücrelerde bulunmaktadır ve endotel hücrelerinin büyümesi, farklılaşması ve göç etmesini düzenlemektedir. VEGFR-2 özellikle tümörle ilişkili endotel hücrelerde yoğun şekilde eksprese edilir ve tümör invazyon ve metastazını stimüle eden anjiyogenezi düzenlemektedir. Anjiyogenez mevcut kan damarlarından yeni damar oluşmasıdır. Günümüzde kanser hücrelerini tedavi etmek için VEGFR-2'yi hedefleyen antikor (Ab) temelli tedavi yöntemleri bulunmaktadır, ancak bunların hiçbiri nihai bir tedavi yöntemi değildir. Bu sebeple yeni ve etkili anti-VEGFR-2 antikor üretimi ile kanser hastalarının tedavisinde başarı elde edebilmek mümkün olacaktır. Rekombinant antikor teknolojisindeki gelişmeler sayesinde; Fab fragmanları, Fv fragmanları ve ScFv fragmanları dahil olmak üzere çok çeşitli antikor molekülleri bulunmaktadır. Full bir antikorun ebatları ile karşılaştırıldığında, scFv'ler küçük moleküler kütleleri sayesinde daha büyük doku penetrasyonuna düşük immünojenisiteye ve düşük vücattan atılım süresine sahiptir. Bununla birlikte, artan agregasyon eğilimi ve düşük termodinamik stabilite gibi zayıf biyofiziksel özelliklere sahip olan ve düşük performans ve uygulama ile sonuçlanan scFv yapısının üretiminin bazı dezavantajları da vardır. Çözünürlük ve stabilite sorunlarının üstesinden gelmek için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Çözünürlük artırma çalışmalarında iki farklı genel yol tercih edilebilir. Bunlardan ilki moleküler mühendislik stratejileri kullanmadan; düşük sıcaklıklar, farklı besi yerleri, farklı suşlar kulanarak yapılabilmektedir. Çözünürlüğü artırmaya yönelik kullanılan diğer bir yöntem ise moleküler mühendislik yöntemleri ile yapılan füzyon, moleküler şaperonlarla birlikte ekspresyon, mRNA stabilizasyonudur. Bu yöntemler ile genel çözünürlükleri önemli ölçüde artırabilirken, bu proteinlerin biyolojik aktivitelerini kaybedebildikleri gözlenmiştir. Çözünürlük tek başına proteinlerin aktif olduğu anlamına gelmemektedir. anti-KDR 1.3 ve anti-KDR 2.6 (anti-VEGFR-2) scFv molekülleri daha önce TÜBİTAK MAM GMBE İmmünogenetik Laboratuvarı tarafından faj görüntüleme tekniği ile geliştirilmiştir. Ancak bu antikorlar inklüzyon cisimcikleri şeklinde üretilebilmekte ve protein agregatları oluşturmaktadır. Ayrıca, bu proteinlerin aktif biyolojik formlara yeniden katlanması çok uzun süre ve emek istemekte ve tekrarlanabilir sonuçlar elde edilememektedir. Ek olarak, protein verimleri genellikle zayıftır. Bu tez ile hedeflenen, anti-KDR scFV moleküllerinin ekspresyon ve solubilite sorununu çözmek ve üretilen hedef moleküllerin anti-anjiyojenik aktivitelerini doğrulamaktır. Bu doğrultuda, tez içerisinde iki farklı yaklaşım benimsenmiştir, ilki hedef scFv moleküllerin memeli hücrelerde üretimi ve Kontrolü, ikinci yaklaşım ise hedef scFv molekkülerin CDR-grafting yöntemi ile farklı bir yapıya aktarılarak bakterilerde üretimini sağlamak ve aktivite kontrolünü gerçekleştirmektir. İlk yaklaşımda, memeli hücre kültüründe hedef scFv protein ekspresyonu araştırılmıştır. Çalışmalar için DNA sekansı belli olan ve genleri hali hazırda klonlama vektöründe bulunan scFv geni kullanılmıştır. Oluşturulan yapılarda farklı sinyal peptitleri ile tasarımlar gerçekleştirilmiştir. Aynı zamanda hedef genler üzerinde belirlenen hücre hattı için kodon optimizasyonları yapılmıştır. Yeni tasarlanan scFv genleri farklı memeli ekspresyon vektörlerine klonlanmış ve E.coli hücrelerine farklı transformasyon yöntemleri ile aktarılmıştır. Daha sonra bu hücrelerden koloni PCR yapılarak klonlanan vektörler tespit edilmiştir. Klonlanmış yeni scFv yapılarının DNA sekansları kapiller elektroforez sistemi yardımıyla gerçekleştirilmiştir. Elde edilen sonuçlar ile sekans analizi yapılmış, genin vektörün içine doğru yerleşimi ve mutasyon içerip içermediği control edilmiştir. Dizilerden elde edilen genler bioinformatik programlar aracılığı ile translate edilmiş ve üretilecek protein de herhangi bir frame kayması olup olmadığı control edilmiştir. Bu sonuçlar doğrultusunda, elde edilen vektörler saflaştırılarak, memeli hücrelerine transfekte edilmiştir. Controlleri yapılan hedef genleri içeren vektörler farklı memeli hücre hatlarında ilk olarak transient transfeksiyonlar gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmalar öncesinde, optimum koşulları belirlemek üzere transfeksiyon optimizasyon çalışmaları yapılmıştır. Daha sonra uygun koşulları belirlenen antibiyotik konsantrasyonları ile stabil transfeksiyon sağlanmıştır. Stabil olarak transfekte edilen hücrelerden seri dilusyon yöntemi ile monoklonal hücreler elde edilmiştir. Hücre kültürü çalışmalarında CHO-K1 hücrelerinin serumsuz besi yerine adaptasyonu ve süspanse hale getirilmesi tamamlanmıştır. Aynı zamanda, hücre kültürü çalışmaları kapsamında farklı besleme stratejileri, farklı sıcaklık denemeleri ve büyük hacim üretim denemeleri gerçekleştirilmiştir. Yeni scFv yapıları memeli hücrelerinde üretilmiş ve saflaştırma çalışmaları FPLC (Fast protein liquid chromatography) cihazı ile yapılmıştır. Elde edilen antikor yapıları SDS-PAGE ve western blot yöntemleri ile analiz edilmiştir. Daha sonra örneklerin VEGFR-2'ye bağlanmaları ELISA ile control edilmiştir. Saflaştırılan antikorlar HPLC (High Performance Liquid Chromatography)'ye dayalı kromatografik yöntemlerle incelenmiştir. Hücreler de m-RNA varlığının araştırılması için gerçek zamanlı PZR yöntemi kullanılmıştır. Bu çalışmalar yanında, bakterilerden elde edilen anti-KDR 1.3 proteinin yapısal dinamiklerinin ortaya çıkarılması için Hidrojen Deuterium Değişimi Kütle Spektrometrisi (HDX-MS) çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Tüm sonuçlar incelendiğinde hedef scFv molekülün memeli hücrelerinde ekspresyonunun solubilite ve üretim açısından avantaj sağlamadığı, üretimin memeli hücrelerde çok zayıf oranda elde edildiği veya üretimin gerçekleşmediğini göstermiştir. Tezin ikinci kısmında farklı bir yöntem benimsenerek daha etkili ve kısa sürede sonuç alınabilecek bir yaklaşım belirlenmiştir. İkinci yaklaşımda, hedef scFv moleküllerinin çözünür bir biçimde eldesini sağlayabilmek için normal koşullar altında insansılaştırma çalışmaları için kullanılan bir yöntem olan CDR grafting yöntemi farklı bir amaçla kullanılmıştır. İnsansılaştırma (CDR grafting), özellikle kemirgen hayvanlar kullanılarak geliştirilen monoklonal antikorların (mAb'ler) immünojenisitesini azaltmak ve bu yapıların insan bağışıklık sistemi aktivasyonunu artırmak için kullanılan bir tekniktir. Biz bu tekniği amacı dışında kullanarak, geliştirdiğimiz antikorun solubilitesinin artırılması için kullanmayı hedefledik. Buradaki hipotezimiz de, çözünür bir biçimde üretim elde edilen scFv yapısının çerçeve bölgelerinin, inklüzyon cisimciği oluşturan bir scFv'yi oluşturan çerçeve bölgeleriyle değiştirilmesi durumunda, geliştirilen yeni scFv yapısının çözünür bir biçimde elde edilebileceğini gösterdik. Grubumuz tarafından daha önce HbsAg'ye karşı geliştirilmiş ve çözünük bir biçimde eksprese edilen scFv'nin (Lig 7) yapısı ile değiştirmek için CDR-grafting yöntemi kullanılmıştır. Bu çalışmada, CDR-grafting tekniğinin eksprese edilen proteinin çözünürlüğü ve etkinliği üzerindeki etkisi araştırılmıştır. Bu çalışma için öncelikle hedef scFv (anti-KDR 1.3) ve (Lig7) moleküllerinin modellemeleri biyoinformatik programlarla yapılmıştır. Bu çalışmalar kapsamında, scFv yapıların sekanslarının karşılaştırması ve homoloji modellerinin karşılaştırmaları yapılmıştır. Bu kapsamda, scFv yapıların moleküler dinamik simülasyonları gerçekleştirilmiş ve oluşturulan yeni moleküller için çözünürlük değerleri belirlenmiştir. Bu çalışmalar ışığında, hedef molekülün CDR bölgeleri Lig7 molekülünün frame bölgeleri ile değiştirilmiştir. Elde edilen yeni oluşturulmuş scFv sekansı için yeni bir plazmit konstraktı tasarlanmış ve ticari olarak sentezlenmiştir. Oluşturulan plazmit konstraktı bakteri hücrelerine transforme edilmiş, Escherichia coli (E. Coli) BL21 suşunda üretim gerçekleştirilmiş ve ekspresyon sonucu çözünür protein üretimi SDS-PAGE ve western blot analizleri ile gösterilmiştir. Elde edilen yeni scFv yapılarının saflaştırma işlemleri histidine kuyruğu kullanılarak FPLC cihazı ile gerçekleştirilmiştir. Saflaştırma sonrası hedef protein üretimi SDS-PAGE ve western blot çalışmaları ile doğrulanmıştır. Elde edilen moleküllerin SPR cihazı ile bağlanma analizleri gerçekleştirilmiş ve orijinal molekül ile karşılaştırılmıştır. Yeni oluşturulan anti-KDR 1.3G moleküllerinin in-vitro aktivite testleri gerçekleştirilmiştir. Hücre deneyleri için HUVEC hücre hattı kullanılmıştır. İlk olarak proliferasyon inhibisyonu deneyi, xCELLigence RTCA DP gerçek zamanlı hücre analiz cihazı kullanılarak empedansa dayalı olarak gerçekleştirilmiştir. Yara iyileştirme deneyi, iki boyutlu alanada toplu hücre göçünü araştırmak için oluşturulmuş bir in vitro tekniktir. Bu deneyde, mekanik parçalama hücre yüzeyinde eşit bir biçimde hücresiz bir alan (bir yara alanı) oluşturulmuştur. Deney sonuçları, HUVEC hücrelerinin boş yara alanlarının yüzde değerleri olarak sunulmuştur. Modelleme sonuçlarına dayanarak, CDR-grafting tekniği ile oluşturulmuş scFv molekülünün çözünürlüğü, orijinal scFv molekülü ile karşılaştırıldığında artmıştır. SDS-PAGE ve Western blot sonuçları, eksprese edilen proteinin çözünürlüğündeki artışı doğruladı. SPR sonuçları, anti-KDR 1.3G molekülünün, orijinal olana kıyasla VEGFR-2 reseptörüne benzer bağlanma afinitelerine sahip olduğunu göstermiştir. HUVEC proliferasyonu ve yara iyileştirme deneyleri dahil olmak üzere in vitro aktivite deneyleri, yeni oluşturulmuş scFv molekülünün anti-anjiyojenik özelliklere sahip olduğunu göstermiştir. Bu çalışma, çözünür biçimde eksprese edilemeyen bir scFv yapısından, özünde çözünür dizilerden türetilen çerçeve bölgelerine CDR -grafting, bağlanma özelliğinde ve aktivitesinde herhangi bir kayıp olmaksızın çözünür bir scFv'nin geliştirilebileceğini göstermiştir. Moleküler mühendislik yaklaşımı kullanarak, bir scFv antikorunun inklüzyon cisimciği oluşturma problemini çözebilen ve zaman alan optimizasyon prosedürlerine olan ihtiyacı ortadan kaldırabilen umut verici bir stratejidir.