Nad+-bağımlı Mutant Q105r Candida Methylica Format Dehidrogenazın Spesifik Aktivitesinin Artırılması

thumbnail.default.placeholder
Tarih
2016-07-22
Yazarlar
Torun, Soner
Süreli Yayın başlığı
Süreli Yayın ISSN
Cilt Başlığı
Yayınevi
Fen Bilimleri Enstitüsü
Institute of Science And Technology
Özet
NAD+-bağımlı format dehidrogenazlar (EC 1.2.1.2) sodyum formatı substrat olarak kullanır ve sodyum formatın CO2‘e dönüşmesini katalizler. Aynı zamanda, NAD+‘i NADH formuna indirger. NAD+-bağımlı FDH’ler, düşük redoks potansiyelinden dolayı, saf kiral bileşiklerin sentezlenmesinde gerekli olan NADH rejenerasyonunu sağlamak için endüstriyel alanda en çok kullanılan enzimlerden biridir. NAD+-bağımlı FDH’lerin düşük aktivite göstermesi ve yüksek sıcaklıkta inaktif olması, bu enzimlerin endüstriyel alanda kullanımı açısından bir dezavantaj yaratmaktadır. Son zamanlarda yapılan protein mühendisliği çalışmaları ile bu dezavantajları en aza indirgemek amaçlanmıştır. Oksidoredüktaz enziminin alt sınıfında yer alan dehidrogenaz enzimleri optikçe aktif maddelerin sentezlenmesinde etkilidirler. Dehidrogenaz sınıfı içerisinde yer alan format dehidrogenazlar (FDH) koenzimlerin rejenerasyonu açısından -özellikle NAD(P)+ rejenerasyonu- endüstriyel ve kimyasal alanda tercih edilen bir enzim haline gelmiştir. Özellikle format dehidrogenazın katalizlediği reaksiyonlarda substrat olarak kullanılan sodyum format bileşiğinin çok ucuz maliyetinin olması ve kolayca elde edilebilir olması, katalizlenen reaksiyon sonucu oluşan karbon dioksitin (CO2) reaksiyon ortamından kolayca uzaklaştırılabilmesi, format dehidrogenaz enziminin çok geniş bir pH aralığında (6.0-9.0) etkinlik gösterebilme kapasitesi ve reaksiyon sonucu oluşan ürün veriminin fazla olması, format dehidrogenazın endüstriyel alanda daha fazla tercih edilmesini sağlamaktadır. Aynı zamanda endüstriyel uygulamalarda format dehidrogenaz enziminin yüksek sıcaklıklarda kullanılması enzimin aktivitesinde büyük dezavantaj teşkil etmektedir (50-60°C arasında enzim aktivitesi yarıya düşmekte, daha yüksek sıcaklıklarda enzim inaktif olmaktadır). Bu nedenden dolayı, son zamanlarda endüstriyel alanda sıcaklığa dayanıklı enzimler geliştirme ihtiyacı ortaya çıkmıştır. Bu ihtiyacı karşılamak üzere son yıllarda protein mühendisliği çalışmaları büyük ölçüde önem kazanmıştır. Geçmiş çalışmalarda FDH’in aktivitesini artırmak üzere birçok organizmada çalışmalar yapılmış ve elde edilmiş olan mutant FDH’ler yabanıl tipteki FDH’ler ile karşılaştırılmıştır. Candida boidini’de (Cb)`den izole edilen FDH`in 23. pozisyonunda bulunan sistein aminoasiti serin aminoasitine (C23S), 285. pozisyondaki fenilalanin aminoasiti serin aminoasitine (F285S) dönüştürülerek spesifik aktivitenin artırılmasına çalışılmıştır. Sodyum format ve NAD+ ya karşı kinetik ölçümler yapılmış ve spesifik aktivitede yaklaşık 1.7 kat artış olduğu gözlemlenmiştir. Candida boidini için yapılan bir diğer çalışmada ise 195., 196., 356. ve 379. pozisyonlarda bulunan aminoasitlere odaklanılmış ve NAD+ ye karşı aktif mutant FDH’ler elde edilmiştir fakat sodyum format ve koenzimler için herhangi bir Km değeri belirtilmemiştir. Saccharomyces cerevisiae FDH’i (ScFDH) için 196. ve 197. pozisyonlardaki aminoasitler üzerine çalışma yapılmış olup, yapılan çalışmalar sonucu koenzim seçiciliğinin NAD+ dan NADP+ ya değiştiği gözlemlenmiştir. Yine spesifik aktiviteyi artırmak amacıyla Pseudomonas sp.101. FDH’e yönelik (PseFDH) birçok çalışma yapılmış olup özellikle 131., 160., 168., 184. ve 228. pozisyonunda bulunan serin aminoasitlerinin alanin aminoasitine dönüştürülerek elde edilmiş olan mutantlar yabanıl tipteki PseFDH’ler ile karşılaştırılmış ve kinetik değerlerde değişme olmadığı saptanmıştır. Candida methylica FDH (CmFDH) için yapılmış olan geçmiş çalışmalarda 195. ve 221. pozisyondaki asparajin aminoasiti serin aminoasiti ile değiştirilmiş olup elde edilmiş olan mutantların yabanıl tipe oranla NAD+ koenzimi için spesifik aktivitesinin daha düşük olduğu gözlemlenmiştir. Yine aynı organizma için 169. ve 226. pozisyonundaki treonin aminoasitleri valin aminoasitine dönüştürülmüş, 169. pozisyonda yapılmış olan mutasyonun kinetik ölçümleri sonucu Kcat değerinde yaklaşık 4 kat azalma olduğu, bu mutasyonun 226. pozisyondaki mutasyonla beraber gerçekleştirildiğinde ise kinetik değerinde herhangi bir değişim gözlemlenmemiştir. Daha çok elektrostatik etkileşim elde etmek amacıyla Candida methylica FDH’sinde 13., 105., 147., 160., 187. ve 302. pozisyonlarda mutasyonlar yapılmış olup, elde edilmiş bu mutantlar tek tek ve ikili veya daha fazla kombinasyonları denenmiş olup sodyum formata karşı aktivitesi artırılamamıştır. Bu çalışmada, daha önceden termal stabilitesi artırılmış olan Candida methylica FDH’nin (Q105R) spesifik aktivitesinin artırılması için protein mühendisliği yöntemlerinden birisi olan yönlendirilmiş-bölge mutagenez yöntemi kullanılmıştır. Geçmiş çalışmalarda, Candida boidinii FDH’inde (cbFDH) K328V mutasyonunun spesfik aktivitesinin artırılmasından dolayı Q105R mutant Candida methylica FDH’inin (cmFDH) üzerine K328V mutasyonu uygulanmıştır. İlk olarak, 328. pozisyonda lizin aminoasidini kodlayan (K328V) AAA kodonunun yerine, valin aminoasidini kodlayan GTT kodonunu içeren primer dizayn edilmiştir. Dizayn edilen primerler ile yönlendirilmiş-bölge mutagenez polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) yapılmıştır. PZR sonucunda elde edilen PZR ürünleri agaroz jel elektroforezinde yürütülüp, yürütülen jel UV altında görüntülenerek yaklaşık 6000 baz çiftine (bp) denk gelen bir bant gözlemlenmiş olup PZR ürünlerinin doğruluğu kontrol edilmiştir. Daha sonra PZR ürünleri DpnI enzimi ile metillenmiş adenin kısmından kesilmiştir ve mutasyon içermeyen DNA’ların uzaklaştırılması sağlanmıştır. Kesilmiş DNA fragmentlerini içeren çift mutant (Q105R/K328V) taşıyan PZR ürünleri pQE-2 vektörü içerisine klonlanıp, daha sonra BL-21 kimyasal kompetent hücreleri içerisine transforme edilmiş ve transforme olmuş hücreler ampisilin içeren katı besiyerine ekim yapılarak 16-20 saat boyunca 37 oC de büyütülmeye bırakılmıştır. Transformasyon sonucunda büyüyen kolonilerden üç tanesi rastgele seçilerek plazmid izolasyon işlemi yapılmıştır. İzole edilmiş olan plazmitler, öncelikle agaroz jelde kontrol edilmiş daha sonra mutasyonun doğruluğunu saptamak amacıyla DNA dizi analizi için gönderilmiştir. Mutasyonun doğruluğunu tespit etmek amacıyla BioEdit programı kullanılmış, elde edilmiş olan mutantlar cmFDH DNA dizisi ile karşılaştırılarak mutasyonun doğruluğu kontrol edilmiştir. Mutant Q105R/K328V kinetik enzim ölçümleri yapılmak üzere, mutant hücreler transforme edildikten sonra ampisilin içeren Luria-Bertani (LB) katı besiyerinde 16-20 saat boyunca 37 oC de büyütülmüş ve büyütülmüş olan hücrelerden protein saflaştırması yapılmak üzere tek koloni alınarak ampisilin içeren 50 ml LB sıvı besiyerine ekimi yapılıp 1 gece boyunca bekletilmiştir. Bekletilmiş olan kültür ampisilin içeren 1 L lik sıvı besiyerine transfer edilmiş olup OD600 değeri yaklaşık 0.6 ya ulaştığında kültür içeresine IPTG eklenerek protein ekpresyonu indüklenmesi sağlanmıştır. İndüklenmiş proteinler HisTrap yöntemi kullanılarak saflaştırılmıştır. Saflaştırılan proteinler SDS-PAGE’de yürütülmüş ve belirlenen protein fraksiyonları kinetik ölçümlerde kullanılması için toplanmıştır. Kinetik ölçümler, sabit NAD+ konsantrasyonunda (4 mM) ve değişen sodyum format konsantrasyonlarında (0-80 mM) 25 oC ’de 340 nm dalga boyunda gerçekleştirilmiştir. Km ve kcat değerlerinin hesaplanmasında Hyper32 programı kullanılmıştır. Hesaplanmış Km ve kcat değerleri Q105R/K328V mutasyonunun spesifik aktiviteyi ve Km değerini düşürdüğü göstermiştir.
NAD+-dependent FDHs (EC 1.2.1.2) use sodium formate as the substrate and catalyze convertion of sodium formate ion into CO2. At the same time, NAD+ is reduced into NADH form. Because of low redox potential, NAD+-dependent FDHs are mostly used enzymes in the industrial area and they provide NADH regeneration for the synthesiz of optical chiral compounds. NAD+-dependent FDHs have some disadvantages such as low specific activity and they can be inactivated at high temperatures especially when they are used in the industrial area. Recently, protein engineering studies are aimed to overcome these disadvantages. In this study, we used site-directed mutagenesis method for increasing specific activity of Q105R mutant Candida methylica FDH whose thermostability was increased. In the previous studies, K328V mutation has been introduced into the Q105R mutant of Candida methylica FDH due to the specific activity of K328V mutation was increased at Candida boidinii FDH. First we have designed primer that codes valine residue at 328th position. Site directed mutagenesis method has been performed by using the designed primers. Then PCR products have been digested by DpnI enzyme which cuts methylated adenine site. Digested DNA fragments carrying the required double mutant (K328V on Q105R) have been cloned into pQE-2 vector then transformed into BL-21 chemical competent cells. Three random colonies have been chosen and purified at the end of the transformation. Purified plasmids have been sent for DNA sequence analysis. The accuracy of mutation has been checked by comparing with DNA sequence. Mutant K328V cells have been cultivated for kinetic measurement and then protein purification has been carried out for cultivation of the cells. Purified protein has been run on SDS-PAGE and chosen fractions have been collected for kinetic measurement analysis. The kinetic measurement has been carried out at 25 oC at 340 nm wavelength with constant NAD+ concentration (4 mM) and changing substrate concentrations (0-80 mM). To calculate Km and kcat value, Hyper32 programme has been used. Calculated Km and kcat value reveals that K328V mutation decreases specific activity and Km value.
Açıklama
Tez (Yüksek Lisans) -- İstanbul Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, 2016
Thesis (M.Sc.) -- İstanbul Technical University, Institute of Science and Technology, 2016
Anahtar kelimeler
Format Dehidrogenaz, Candida methylica, NAD+-Bağımlı, Spesifik aktivite, Formate Dehydrogenase, Candida methylica, NAD+-Dependent, Specific Activity
Alıntı