Yvfı Mutant Sporları Karakterizasyonu

Abstract

Bacillus subtilis de sporulasyon, besin yetersizliği gibi olumsuz koşullara yanıt olarak, bakteri metabolizmasının gelişim aşamasında meydana gelen farklılaşmadır. Bu süreç, hücre dışı ve hücre içi sinyallere bağlı olarak, farklı gen ürünlerini ve faktörlerini harekete geçirecek bir düzenleyici sistem içerir. Ayrıca, bu sıradışı olan gelişimsel aşama farklılaşmada rol oyanayan bir çok gen arasındaki ardışık ve karmaşık etkileşimlerden oluşur. Sporulasyonun tamamlanması üzerine eğer koşullar büyüme için tekrar elverişli hale gelirse, olgunlaşmış spor çimlenir ve çimlenme sonrası büyüme evresi olan outgrowth aşamasına geçer. Ayrıca, sporun yapısı ve kimyasal bileşimi spor direnci ve çimlenme profilinde önemli bir rol oynamaktadır. Spora dirençliliğini sağlamada büyük role sahip üç önemli molekül vardır. Bu moleküller küçük asitte çözülebilen proteinler (SASPs), spor ceket proteinleri ve dipiklonik asittir (DPA). SASP’ ler sadece ısıya, çeşitli kimyasallara UV radyasyonuna karşı spora dirençlilik sağlamada önemli unsur olmayıp aynı zamanda çimlenme sırasında protein sentezi için amino asit sağlarlar. Dahası, spor ceketi bazı kimyasallara, spor korteksinin yıkımını sağlayan egzojen litik enzimlere ve saldırgan protozoalara karşı dirençlilik sağlar. Bunlara ek olarak, spor çekirdeğindeki DPA birikimi sporulasyonda spor çekirdeğindeki suyun azalmazından sorumlu olup aynı zamanda spor DNA’sının UV fotokimyasında önemli bir rol oynamaktadır. Sporlanmaya spesifik genlerin çeşitli antibiyotiklerle etkileşime girdiğine ilişkin raporlar sonucunda antibiyotiklerin sporlanmayla ilgili fonksiyonlarının olduğu hipotezi güçlenmiştir. Önceki çalışmalarda 125 kDa ağırlığında küçük bir dipeptid antibiyotik olan basilisinin sporlanmada kontrol elementi olabileceği gösterilmiştir. Ayrıca, son zamanlarda Bacillus subtilis de yvfI geninin basilisin biyosentezinde gerekli olduğu iddia edilmektedir. Yukarıda belirtilen sporulasyon ve yvfI geni arasındaki olası ilişkiyi ileri süren bulguların ışığı altında, mevcut projenin amacı yvfI geni ürününün olası etki bölegerinin sporulasyon süreci sırasında incelemektir. Bu amaçla, bu çalışmada yabani tip PY79 ve onun basilisin defektif türevi TEK1 (yvfI::Tn10::spc) sporlarının temel spor özellikleri karşılaştırıldı. Dirençlilik profillerini karşılaştırmak amacıyla, hem mutant suş hem yabanil suş sporları lizozim, ısı, hidrojen peroksit ve kloroforma maruz bırakıldı. Bunu takiben, SASP ve spor ceketi proteinleri, hem yabanil suş PY79’dan hem basilisin defektif suş TEK1’den izole edilmiştir. SASPs analizinde, üç ana bant olarak görüntülenen α, β, γ-tipi SASP’ lerin, düşük pH’ lı poliakrilamit jel elektroforezi kullanılarak her iki suşta da eksprese edildikleri gözlemlenmiştir. Diğer yandan PY79 sporları, TEK1 sporlarından az sayıda spor ceketi proteiniyle ayrılır. TEK1 ve PY79 sporlarının çimlenme ve outgrowth karakteristikleri incelenmiştir ve bu sayede yvfI geninin sporlanmada fonksiyonu detaylı gözlemlenmiştir. Sonuçlar göstermiştir ki, TEK1 ve PY79 sporları yalnızca zengin besiyeri olan 2x YT’ de değil aynı zamanda SMM fakir besiyerinde de çimlenme ve outgrowth profili göstermiştir. DPA seviyeleri yukarıda belirtilen suşlarda karşılaştırılmış. Son olarak, Bacillus subtilis ‘de sporulasyon sürecinde yvfI gen ürününün fonksiyonel rolünü incelemek amacıyla PY79 ve TEK1 sporlarının DSM agarda koloni morfolojisi incelenmiştir

In Bacillus subtilis, sporulation process is a developmental stage of differentiation in response to unfavourable conditions such as nutrient insufficiency. This process involves an extracellular or intracellular signal dependent pathway employing many different gene products and factors to create a response regulatory system. Upon completion of sporulation, if the conditions return to favourable for growth, fully maturated spore germinates and turn to vegetative stage. Moreover, spore’s structure and chemical composition displays the important role in spore resistance and germination profiles. There are three crucial molecules in the spore that play major roles in providing resistance to spores. Those molecules are small acid-soluble proteins (SASPs), spore coat proteins and dipicolinic acid (DPA). SASPs are not only significant elements in spore resistance against heat, many chemicals, UV radiation but also they provide amino acids for protein synthesis during germination. Moreover, the coat provides resistance against some chemicals, exogenous lytic enzymes that can degrade spore cortex and predation by protozoa. Furthermore, the accumulation of DPA in the spore core is responsible for the reduction in core water content during sporulation and additionally DPA plays a significant role in the UV photochemistry of spore DNA. There are so many reports regarding the involvement of the peptide antibiotics in the sporulation process. Consistently, previous studies have implied that bacilysin, which is a small dipeptide antibiotic of 125 kDa, might be a control element in the sporulation process. Recently, yvfI gene was identified as a noval gene essential for bacilysin biosynthesis in Bacillus subtilis. As a further step, based on the relationship between YvfI and bacilysin biosynhesis, the present project aims to elucidate a possible effect of the yvfI gene product on the sporulation process. Under this respect, spore properties of wild type PY79 and its YvfI defective derivative strain TEK1 (yvfI::Tn10::spc) strains were compared. In order to investigate resistance profiles, both mutant type and wild type spores were treated with lysozyme, heat, hydrogen peroxide and chloroform. Subsequently, both small acid soluble proteins (SASPs) and spore coat proteins were extracted from spores of both wild type PY79 and yvfI disrupted strains. In case of SASP analysis, both PY79 and TEK1 spores were observed to express α, β and γ type SASPs as visualized like three main bands on a low pH PAGE. On the other hand, PY79 spores were examined to differ from TEK1 spores by a small number of spore coat proteins. Germination and outgrowth characteristics of TEK1 and PY79 spores were performed in order to examine the functional role of yvfI during the sporulation process, in detail. Both strains have displayed germination and outgrowth properties not only in rich medium 2x YT and but also in SMM medium. Level of DPA of above mentioned strains were also compared. Finally, the morphology of colonies of strains PY79 and TEK1 formed on the agar plate containing DS medium were also examined in order to fulfill the overall aim of exploring more details about the functional role of yvfI gene product on the sporulation process in Bacillus subtilis.