Amonyağı Oksitleyen Arke Lerin Atıksu Arıtımındaki Rolünün Moleküler Tekniklerle Belirlenmesi

Abstract

Amonyak amonyağı-oksitleyen organizmalar tarafından nitrite dönüştürülür ve bu reaksiyon nitrifikasyonun hız belirleyen adımını oluşturur. Amonyak monooksijenaz (AMO) amonyak oksidasyonundan sorumlu enzimdir ve DNA dizilemesinde sıklıkla kullanılır. Yakın zamana kadar amonyağı sadece amonyak oksitleyen bakteriler ve anaerobik amonyak oksitleyen bakterilerin (anammox) oksitleyebildiği biliniyordu. Son zamanlardaki çalışmalar, amonyağı oksitleyen Arkerin de amonyağın oksitlenmesinde rol aldıkları gösterilmiştir. Arkelere ait amoA geni birçok çevre örneklerinde amonyağı oksitleyen bakterilere göre daha fazla ve aktif olarak bulunmaktadır. Amonyak oksitleyen Arkeler (AOA) ayrıca atık su arıtma tesislerindeki biyolojik nitrojen gideriminde de önemli rol oynayabilmektedir. Bu çalışmada, Petrol, yağ, gıda, alkol, kimyasal endüstri ve çöp sızıntı suyu atıksu arıtması gibi, onaltı farklı evsel ve sanayi atık su arıtma tesisinden örnekler toplanmıştır. AOA ve Amonyak oksitleyen bakterilerin (AOB) varlığı arkeal ve bakteriyel amoA genine özgü iki primer çifti kullanılarak kantitatif realtime PZR yöntemi ile çalışılmıştır. Ayrıca Arkeal Amo A geni klonlanarak dizilenmiş ve filogenetik ağaç elde edilmiştir. Atıksu arıtma tesislerindeki amonyum konsantrasyonlarına bağlı olarak tesisler arasında AOA ve AOB miktarlarının farklılaştığı bulunmuştur. DNA dizi analizi sonrası, AOA ların büyük bir kısmının deniz grubunu içeren (Grup 1.1a) kümesine dahil olduğu saptanmıştır. Küçük bir grup AOA ise toprak kümesine (Grup 1.1a) ait çıkmıştır. Diğer bir küme olan termofilik AOA kümesine ait Arkeler tespit edilememiştir. Saf kültür çalışmaları, amonyak miktarı ve oksijen içeriğinin AOA varlığını ve kominite yapısını etkileyen en önemli iki faktör olduğunu göstermektedir. Fakat, bu iki substratı AOB de kullandığından bu iki grup arasında atıksu arıtma tesislerinde oksijen ve amonyak için yarışma vardır. Tüm örneklerde AOA varlığı 103 - 108 gen kopya sayısı arasında gösterilmiştir. Düşük amonya miktarlarına sahip evsel atık arıtma tesislerinde AOA amoA gen kopya sayısının yüksek çıkması bu tesislerde AOA’nın potansiyel ototrofik amonyak oksidasyonunda rol alabileceğini göstermektedir. NH3 konsantrasyonu gibi konvansiyonel parametrelerin atıksu arıtma tesislerinde AOA varlığının tespitende kullanılabileceği bulunmuştur. Bu bulgu atıksu arıtma sistemlerinde AOA’nın nitrojen gideriminde rol alabileceğini düşündürmektedir. Arkeal amoA gen kopyası hücre başına 1 kopya iken bakteriyel amoA gen kopyası 2,5 dur. Bu bilgi göz önünde bulundurulduğunda AOB kopya sayısı sadece amonyak konsantrasyonu en yüksek olan ISTAÇ ve Pakmaya atıksu arıtma örneklerinde AOA kopya sayısını geçmektedir. Arkeal amonyak mono-oksigenaz amonyaga karşı bakteriyel enzinden daha yüksek afiniteye sahiptir. Genellikle AOA amonyak konsantrasyonunun düşük olduğu ortamlarda daha fazla bulunmaktadır. Bu durum bizim çalışmamızla da uyumludur. AOB ve AOA tüm örneklerde bulunmasına rağmen, atıksu arıtma tesislerinde nitrifikasyona birlikte katkı sağlamaktadırlar. AOA düşük amonyak derişimine sahip tesislerde baskın türler iken AOB yüksek amaonyak derişimine sahip tesislerde baskındır. Bu sonuç yeni literatürle de uyumludur. Düşük amonyak derişimine sahip evsel atıksu arıtma tesislerinde önemli miktarda AOA varlığı bu tesislerde potansiyel amonyak oksitleyen organizma olduğunu göstermektedir. Bu bulgu atıksu arıtma tesislerinde amonyak giderimi üzerindeki bilgilerimizi değiştirebilir. Doğada AOA varlığı ve aktif olarak biyojeokimyasal çevrime katkıda bulunduğu rapor edilmiştir. Bu bilgi ışıgında, AOA nın atıksu arıtmada amonyak gideriminde rol alabileceği düşünülmelidir. AOA amoA gen ifade miktarlarının tespit çalışmaları ileride nitrifikasyonda AOA katkısını daha iyi bir şekilde ortaya koyabilir. amonyak konsantrasyonu ile AOA ve AOB miktarları rasındaki ilişkide hala aydınlatılmamış noktalar bulunmaktadır. Aşırı düşük çözünmüş oksijen konsantarsyonları atıksu arıtma sistemlerinde AOA büyümesini teşvik edebilir, bununla birlikte, tam ters sonuçlar da elde edilmiştir. Çözünmüş oksijen düzeyi 3.25 mgl−1 olan atıksu arıtma tesisinde yüksek miktarlarda AOA varlığı saptanmıştır. Bazı çalışmalarda, istatistiksel analizler sonucu atıksu arıtma tesisi havalandırma havuzunda çözünmüş oksijen miktarı ile AOA miktarı arasında korelasyon bulunamamıştır. Bazı çalışmalar ise çözünmüş oksijen miktarının AOA varlığı üzerine etki eden en önemli etkenlerden birisi olduğunu belirtilmektedir. Çalışmalardaki bu tutarsızlıklardan dolayı çözünmüş oksijen miktarının AOA ve AOB miktarları üzerine etkisi hala tartışmalıdır. Bizim çalışmamızda, AOB amoA gen miktarı kimyasal oksijen ihtiyacı ile pozitif olarak korelasyon göstermiştir (iki yönlü parametrik olmayan Spearman’s rank korelasyon etkin değeri < 0.05). Fakat AOA amoA gen miktarı kimyasal oksijen ihtiyacı ile negatif olarak korelasyon göstermiştir (iki yönlü parametrik olmayan Spearman’s rank korelasyon etkin değeri < 0.05). AOB amoA gen miktarı amonyak miktarı ile pozitif olarak korelasyon göstermiştir (iki yönlü parametrik olmayan Spearman’s rank korelasyon etkin değeri < 0.05), bununla beraber AOA amoA gen miktarı amonyak miktarı ile korelasyon göstermemiştir (iki yönlü parametrik olmayan Spearman’s rank korelasyon etkin değeri < 0.1933). Bu sonuçlara göre AOA ekotipleri çok esnek olabilir ve bazı AOA türleri miksotrofik olabilir. Mußmann ve arkadaşları tarafından yapılan çalışma atıksu arıtma sisteminde AOA aktivitesinin ilk ve tek kanıtı olabilir. Bu çalışmada elli iki tesisin sadece dördünde yüksek miktarlarda AOA tespit etmişlerdir. Bir tesisi derinlemesine araştırdıklarında AOB den on bin kat daha fazla AOA tespit etmişlerdir. Fakat yapılan modelleme çaılışması sonucunda bu tesisteki amonyak miktarı tüm amonyak oksitleyen organizmalara yetemeyeceği tespit edilmiştir. Sistemde bulunan AOA ların sadece % 1 ine yetecek miktarda amonyak bulunmaktadır. Bu sebepte sistemde bulunan AOA ların enerjilerinin tümünü nitrifikasyondan elde edip etmedikleri tartışma konusudur. Floresans in situ hibridizasyon ve 14C-inorganik karbon izotopu kullanılarak yapılan mikro-otoradyografi çalışmasında AOB nin aksine AOA lar kemo-ototrofik olarak aktif olmadıkları gösterilmiştir. Bu sonuç sonunda bu tesiste AOA ların amonyak oksitlemedikleri sonucuna varılmıştır. AOA lar muhtemelen diğer metabolik yolları kullanarak atıksuda bulunan karbon ve enerji kaynağını kullanmaktadırlar. AOA ve AOB’lerin atıksu arıtma sistemlerinde amonya giderimindeki rollerinin belirlenebilmesi için daha ileri çalışmalar yapılmalıdır. Sonuç olarak, atıksu arıtma sistemlerinde AOA varlığı tespit edilmiş fakat bu grup atıksu arıtma sistemlerinde potansiyel nitrifierlar olarak düşünülemeyebilir.

Ammonia is converted to nitrite by ammonia-oxidizing organisms and this process is often the rate-limiting step of nitrification. Ammonia monooxygenase (AMO) is one of the key enzymes responsible for ammonia oxidation and amoA gene is frequently used for DNA fingerprinting. It had been known that only ammonia oxidizing bacteria (AOB) and anaerobic ammonia oxidizing bacteria (anammox) oxidized the ammonia. Recent studies showed that Ammonia oxidation is also performed by ammonia oxidizing archaea (AOA). Archaeal amoA gene is much more abundant and active than ammonia oxidizing bacteria (AOB) in various environmental samples. AOA might also play an important role in biological nitrogen removal reactors of waste water treatment plants. Accordingly, in this study, activated sludge samples were collected from 16 different domestic and industrial wastewater treatment plants where nitrification was active, including petroleum and oil refineries; food, alcohol and chemical industries and landfill leachate treatment plants. The presence of AOA and AOB in engineered systems was investigated using two primer sets specific for archaeal and bacterial amoA gene sequences via quantitative real time PCR. It was found that the comparative abundance of AOA and AOB amoA genes varied among the WWTPs with regard to the ammonium concentrations in the effluent wastewater of the WWTPs. Surprisingly in almost all of the samples, AOA occurrence has been showed within the 103 - 108 copy numbers. Significant numbers of AOA amoA genes occurred in all municipal WWTPs suggesting the potential role of AOA in autotrophic ammonia oxidation in WWTPs receiving low ammonium influent. It has been confirmed that conventional parameters such as NH3 concentration might be a good tool to predict AOA occurrence in engineered systems The finding of this study may change our understanding on nitrogen removal in WWTPs. AOA must also be considered as another microorganism potentially involved in nitrogen removal in WWTPs. Further studies should clarify the role of AOA and AOB in autotrophic oxidation of ammonia in WWTPs. This may be done by employing a combination of in situ activity investigations and molecular tools As a result, AOA has been found in industrial engineered systems, whereas it may not be considered as a potential nitrifier in wastewater treatment plants.