Olası Koşaperon Mzb1 Proteininin Grp94 Şaperonu Üzerindeki Etkisi

Abstract

Glükoz regüle protein 94 (Grp94) ısı şok protein ailesinin üyesi olan Hsp90’ın endoplasmik retikulum (ER) paraloğudur. Birçok çalışmada Grp94 sekresyona uğrayan veya hücre membranında fonksiyon gösteren çeşitli proteinlerin efektif ekspresyonu ile ilişkilendirilmiştir. Grp94 ökaryotik hücreler için elzem bir şaperondur ve üzerine yapılan bazı fonksiyonel çalışmalar Grp94’ün Toll-like reseptörü, integrin ailesi gibi bazı proteinlerin son yapılarının kazanmasında ve antikor sekresyonunda rol aldığını göstermiştir. Endoplasmik retikulum organelinin protein içerik ve katlanma profili hücre sitozolüne oranla çok büyük farklılıklar göstermesi Grp94’ün farklı özellikler kazanarak evrimleşmiş olabileceğinin en önemli göstergesidir. Bu özellikler Grp94’ün otantik ER proteinlerin katlanma sürecinde rol oynamasını evrimsel süreç içerisinde önünü açmış olabilir. Örneğin, Grp94’ün müşteri proteinlerin dikkate değer en önemli farklılığı disülfid bağ(lar) içermeliridir. Hsp90 ailesindeki tüm homologlar aynı domain organizasyonuna sahiptir; sırasıyla N-terminal domain, orta domain (M) ve C-terminal domaindir. Grp94 de aynı domain sıralamasına sahip olmasına rağmen, kendine özgü konformasyona adapte olmuştur. Bu konformasyon literatürde ‘Kıvrılmış V Konformasyonu’ olarak adlandırılmış olup Hsp90 konformasyonunda katalitik aktivite ile ilişkilendirilmiş ‘N-terminal domain dimerleşmesini’ mümkün kılmayacak niteliktedir. Nükleotid regüle olan Hsp90 ailesi ATP’nin bağlanmasıyla N-terminal domain dimerizasyonu ile başlayan büyük konformasyonal değişikliklere uğrar ve ardaşık konformasyonlar ATP’nin hidrolizi ve ADP’nin salınmasıyla sona erer. Bu veriler Grp94’ün ATPaz deviri sırasında hangi seviyede tanımlanan konformasyonlara adapte olduğunun irdelenmesine sebep olmaktadır. Grp94’ün ‘Kıvrılmış V Konformasyonu’ ATP aktivitesi için uygun olmamakla beraber, kristal yapısı (AMP-PNP ya da ADP) nükleotid kimliği ile değişmemiştir. Hsp90 şaperon protein ailesinin ATP ile tetiklenen konformasyonel deviri ATP’nin N-terminal domainde yer alan nükleotid bağlanma oyuğuna yerleşmesiyle başlar. Kapak görevi gören N-terminal yapı birimi ATP’nin üzerini kapatacak şekilde pozisyonlanması ile iki protomerin N-terminal domainleri dimerleşmesi tetiklenir. Bu konformasyonun dimerizasyonu daha sonra M domainin N-terminal domain ile temas kurmasına sebep olur ve ATP’nin kimyasal parçalanması vuku bulur. Daha sonra ADP ve Pi N-terminal domaini terk eder. Böylelikle Hsp90 tekrar yeni bir ATPaz devirine başlamaya hazır başlangıç konformasyonuna tekrar adapte olur. Grp94’ü diğer sitozolik Hsp90 üyelerinden ayıran bir diğer özelliği ATP’ye ve ADP’ye bağlanma eğiliminin aynı seviyede olmasıdır. Hem konformasyonel hem de bağlanma eğilimi açısından Grp94’ün ATP ve ADP’ye karşı profilinin değişmemesi Grp94’ün ATPaz devirisi sırasında hangi düzeyde sitozolik Hsp90 üyelerinden farklılık gösterdiği sorusunun sorulmasına sepeb olmaktadır. Grp94’ün herhangi bir koşaperonun yardımı ile ATPaz devirinin regüle edilip edilmediği veya müşteri proteinleri ile etkileşime girmesinin sağlanıp sağlanmadığı uzun süren bir muammadır. Ayrıca, Grp94’ün birtakım potansiyel koşaperonlar ile etkileşime girdiği ve fizyolojik önemi açısından literatür bilgisi olmasına rağmen, müşteri proteinlerinin olgunlaşmasındaki fonksiyonu ve bu etkileşimin yapısal-mekaniksel altyapısı hakkında herhangi bir ipucu şu ana kadar literatürde belirtilmemiştir. Potansiyel koşaperonların Grp94 üzerindeki etkisini araştıran üzerine şu anda kısıtlı bilgiler mevcuttur. Bu tezde potansiyel koşaperon olarak düşündüğümüz pERp/MZB1 proteini kararlı hal kinetiği deneylerinde kullanılarak Grp94’ün ATPaz aktivitesine etkisi araştırılmışır. pERp1 nispeten yeni keşfedilmiş bir endoplazmik retikulum proteini olup hücre içindeki fonksiyonu tam olarak bilinmemektedir. Literatürdeki çalışmalar pERp1’in büyük olasılıkla özgün bir oksidoredüktaz ya da şaperon olduğunu ileri sürmektedir. Üzerine yapılan çalışmalardan bazıları pERp1’in BiP (Hsp70’in ER paraloğu) ve Grp94 gibi endoplazmik retikulum şaperolarıyla etkileşiğini ortaya koymuştur. Ek olarak, önceki çalışmalar pERp1’in immünoglobin katlanmasında, hafif zincirlerin takımlaşmasında ve sekrasyonunda rol aldığıni göstermiştir. Tez kapsamında, yabanıl tip Grp94 ve hem N-terminal hem de C-terminal domain uçlarında kırpılmış ubikuitin eklenmiş, manipüle tip Grp94 (Ubi-Grp94-Ubi) ATPaz ve dairesel dikroizm spektroskopi deneyleri ile karşılaştırılmıştır. Bu deneylerdeki asıl amaç yabanıl ile manipüle edilmiş tip arasında kaydadeğer kinetik ve yapısal farklılıkların ortaya konmasıdır. Zira manipüle tipin (Ubi-Grp94-Ubi) klonlanmasının altında yatan sebep, yabanıl tipin içeriğinde bulunan 3 sistein amino asit molekülünün ‘tek molekül çalışmasında’ kullanılan, ticari florofor boyası Atto 488 ile kimyasal tepkimeye girmemesidir. Kırpılmış ubikuitin proteinin kimyasal olarak tepkimeye girebilecek, yapısal anlamda açıkta 1 sisteini bulunmaktadır. Ayrıca, potansyel koşaperon pERp1 ATPaz deneylerine eklenerek Grp94 üzerindeki kinetik etkisi araştırılmıştır. Kararlı hal kinetiği çalışmaları içerisinde farklı pERp1 konsantrasyonları Grp94’ün ATPaz aktivite deneylerine uygulanarak ‘Etkili Konsantrasyon (EK50)’ hesaplanmıştır. Hesaplanan EK50 değeri pERp1 Grp94 arasındaki bağlanma eğilimi hakkında ilk bilgiyi ortaya koymuştur. Bu deneylerle pERp1’in Grp94 ATPaz aktivitesini önemli ölçüde arttırdığı gösterilmiştir. Ek olarak, Ubi-Grp94-Ubi versiyonunun ATP’ye bağlanma eğilimi Km hesabıyla ortaya konulmuş ve literatürde önceden belirlenen yabanıl tip Km’si ile karşılaştırılmıştır. Deney sonucu manipüle tip Grp94’ün ATP’ye olan bağlanma eğiliminde düşüklük saptanmıştır. Şaperon proteinler normal büyüme koşullarında protein katlanmasını katalizlemesi yanı sıra termal stress gibi sert koşullarda hücre içerisinde proteinlerin yanlış katlanmasını ve kümeleşmesini önlemektedir. Hsp90 ailesi kendi müşteri proteinlerinin son olgunlaşma evresinde rol oynamaktadır ancak birçok şaperon ailesi gibi sert koşullar altında müşterisi olmayan proteinlerin stabilizasyonunda da rol almaktadır. Tez kapsamında, pERp1 ve Ubi-Grp94-Ubi proteinlerinin kümeleşmeye olan etkisi model protein sitrat sentaz kullanımıyla gerçekleştirilmiştir. Sitrat sentaz mitokondri matriksinde bulunan yüksek ısı koşullarında kümeleşmeye eğilimli bir enzimdir ve kümeleşme düzeyi spektroskopik yöntemlerle kolaylıkla takip edilebildiği için şaperon proteinlerin fonksiyonel çalışmaları için uygun bir modeldir. Kinetik deneylere ek olarak, bu deney pERp1’in jenerik bir şaperon olmadığını aksine kümeleşmeyi hızlandırdığı ancak manipüle tip Grp94’ ün fonksiyonel anlamda etkin olduğunu göstermiştir. Önceki çalışmalar, pERp1 ve Grp94 etkileşiminin immünoglobin biyosentezi için önem taşıdığını ortaya koymuştur. Bu çalışmalarda Grp94-pERp1 etkilişimi ko-immünopresipitasyon deneyleri ile açıklığa kavuşturulmuştur. Tez kapsamında, bu etkileşimin bir başka yöntem olan analitik jel filtrasyon deneyleri ile validasyonu amaçlanmıştır. Ayrıca bu teknik pERp1 proteininin oligomerizasyon karakterinin belirlenmesinde fikir vermiştir. Tez içeriği Grp94’ün olası bir koşaperon ile yapısal ve mekaniksel yaklaşımlar içeren bir projenin başlangıç aşaması niteliğindedir. Tez kapsamında önemli kinetik verilere erişilmiş olup pERp1’in Grp94 ATPaz devirinde etkili bir ajan olduğu saptanmıştır. Bu veriler çerçevesinde pERp1’in Grp94 konformasyonu üzerine genel senaryolar tartışma kısmında açıklanmaştır. Temel soruları açıklığa kavuşturacak etkileşimin yapısal analizi ve tek molekül çalışmaları Grp94 koşaperon muammasında temel tekniklerdir.

Grp94 is Hsp90 paralog, residing in endoplasmic reticulum (ER), implicated in efficient expression of various proteins secreted and presented on cell membrane. As an essential eukaryotic chaperone, a set of studies have already shown that Grp94 involves in maturation of Toll-like receptors, integrin family members and antibody secretion. Since the condition of ER significantly differs from that of the cytosol, Grp94 must have been uniquely evolved from its cytosolic counterparts in order to deal with distinct client profile of ER. It is known that vast majority of Grp94 clients possess at least one disulphide bond whose formation is crucial to attain 3-D structure and stability for many ER proteins. Besides, ER is much more oxidizing than cytosol due to its enzymatic components catalysing disulphide formation. Despite of having same domain organisation with those of other Hsp90 family members, in which N terminal domain preceding M domain and finally C-terminal domain functioning in dimerization, Grp94 has significant conformational differences compared to its cytosolic counterparts. Most importantly, unlike other Hsp90, in the presence of AMP-PNP or ADP, Grp94 adopts same twisted V conformation which seems to make N-terminal dimerization unfavourable. It must be noted that binding of ATP makes Hsp90 family members undergo some conformational changes in which N- terminal domains of each protomer dimerize resulting in ATP hydrolysis. Furthermore, unlike its cytosolic counterparts, Grp94 does not show different affinity profile for ATP and ADP. These data has been leading an intriguing question regarding to the extent in which Grp94 differs from its cytosolic homologs in undergoing conformational changes during its ATPase cycle. It is long standing enigma as to whether Grp94 is regulated by a co-chaperone which may mediate client loading or remodel ATPase cycle to function in maturation of a set of ER proteins. Even though some studies have shown that a set of protein interact Grp94 along with clues concerning physiological relevance, our current understanding of the precise nature of interaction in these presumptive proteins with Grp94 and their regulatory effects on Grp94 conformational changes are still infant. pERp1/MZB1 is relatively newly discovered protein residing in ER. Its function has not been fully understood, which presumably act as an unique oxidoreductase or chaperone. In previous studies, it has been demonstrated that pERp1 interacts with ER chaperones, Grp94 and BiP. In the context of this thesis, wild type Grp94 and a flanked at both terminal domains by partial ubiquitin version of Grp94 are compared by subjecting to ATPase assay and circular dichroism spectroscopy. The main aim is to check whether ubiquitin tagged Grp94 has no significant difference from wild type in ATPase kinetics and secondary structure. It must be noted that this version was important to do further investigation on Grp94 by single molecule study. Moreover, titration of pERp1 has been performed to calculate EC50 which is an indicator of binding affinity. Apart from steady state kinetics, citrate synthase aggregation assay and analytical size exclusion chromatography are applied to the respective proteins.