Sülfür Dioksite Dirençli Saccharomyces Cerevisiae Nin Evrimsel Mühendisliği

Abstract

Sülfür dioksit, özellikle içecek endüstrisinde benimsenmiş en önemli antioksidan ve antimikrobiyal ajanlardan biridir. SO2, optimum olarak, düşük pH seviyelerinde etki göstermektedir. SO2’in serbest formu olan moleküler-SO2, basit difüzyonla pH seviyesini düşürdüğü hücre içi ortama geçerek hücrelere ağır hasar verir. Sülfür dioksite dayanıklı maya türleri ilaç araştırmalarındaki öneminin yanında endüstriyel öneme de sahiptir. Bu çalışmanın amacı, evrimsel mühendislik yöntemi ile Saccharomyces cerevisiae mayasını sülfür dioksite dirençli hale getirerek, elde edilen mutantların fenotipik değişikliklerinin analizi yoluyla, SO2 tolerans mekanizmasının anlaşılmaya çalışılmasıdır. Bu amaçla, kimyasal olarak mutasyona uğratılmış, genetik çeşitliliğe sahip Saccharomyces cerevisiae başlangıç popülâsyonuna kesikli kültürde seçilim protokolleri uygulanmıştır. Mutant popülâsyonlar, birbirini takip eden her kesikli kültürde kademeli olarak arttırılan SO2 seviyelerine maruz bırakılmıştır. Sülfür dioksit en yüksek etkinliği düşük pH seviyelerinde gösterdiği için seçilimler sabit pH değerinin 3.5’te sabit tutulduğu bir biyoreaktörde ve başlangıç pH değeri 3.5’e ayarlanmış kültür tüplerinde yapılmıştır. Hem biyoreaktör hem de kültür tüplerinden mutant nesiller elde edilmiştir. Elde edilen son nesillerden rastgele olarak mutant bireyler seçilmiştir. Bu mutantlar, Most Probable Number metodu yardımıyla, SO2 direnci ve çeşitli başka streslere karşı geliştirdikleri dirençler için analiz edilmiştir. Sonuç olarak, farklı pH değerlerinde elde edilen mutantların SO2 direnci bakımından fazla değişiklik göstermedikleri; fakat başlangıçta haploit olan biyoreaktör mutantlarının diploit hale gelmelerine ek olarak farklı çapraz direnç modelleri gösterdikleri görülmüştür.

Sulphur dioxide is one of the most preferred anti-microbial and anti-oxidant agents adopted especially in beverage industry. The activity of SO2 is optimum at low pH levels. Free form of SO2, namely the molecular-SO2, can freely pass into cells via simple diffusion where it inflicts detrimental effects upon cells. Yeast species with elevated resistance to SO2 are of industrial interest besides pharmaceutical importance. In this study, the aim was to improve SO2 tolerance of Saccharomyces cerevisiae by evolutionary engineering strategy and to gain insight into the SO2 tolerance mechanism by analyzing phenotypic alterations of the mutants. For this purpose, batch selection protocols were applied to a genetically diverse, chemically mutagenized initial population of Saccharomyces cerevisiae. Mutant populations were exposed to gradually increasing SO2 levels at each successive batch cultivations. SO2 is the most active at low pH levels, thus selections were performed in a bioreactor at a constant pH of 3.5 and in culture tubes with an initial pH of 3.5, which was to decrease as the cells grow. Mutant generations were obtained from both selections in the bioreactor and culture tubes. Individual mutants were randomly selected from the final generations of each selection. These mutants were analyzed for their SO2 resistance along with resistance to various other stresses utilizing Most Probable Number method. Results showed that mutants obtained under different pH conditions did not differ significantly in SO2 resistance, however, they all exhibited different cross-resistance patterns in addition to the initially haploid bioreactor derived mutants becoming diploid.