Pycnoporus Sanguıneus’tan Lakkaz Cdna’larının Klonlanması, Pıchıa Pastorıs’te Ekspresyonu Ve Rekombinant Lakkazların Karakterizasyonu

Abstract

Lakkazlar aromatik bileşiklerin oksidasyonunu, oksijenin suya indirgenmesiyle katalizleyen çoklu bakır oksidazlardır. Geniş uygulama alanları sayesinde doğa dostu bu enzimlere olan ilgi gün geçtikçe artmaktadır. Beyaz çürükçül küf mantarı Pycnoporus sanguineus MUCL 38531’te lakkaz kodlayıcı lcc1 ve lcc2 genlerinin izolasyonu ve bu genlerin heterolog ekspresyonları ile karakterizasyonu ilk kez bu çalışma ile bildirilmektedir. Pycnoporus sanguineus genomunun taranması sonucunda iki farklı lakkaz kodlayıcı genin varlığı belirlenmiş ve bu genler lcc1 ve lcc2 olarak adlandırılmıştır. İzole edilen tam boyda lakkaz cDNA’ları maya mekik ekspresyon vektörü pPICZB’ye kendi sekresyon sinyal dizileri ile klonlanmış ve metilotrofik maya Pichia pastoris’te eksprese edilmiştir. Besiyeri, metanol ve bakır konsantrasyonlarının ekspresyon düzeyi üzerindeki etkisi belirlendikten sonra lakkazlar amonyum sülfat çöktürmesi, iyon değiştirme ve jel filtrasyon kromatografisi teknikleriyle saflaştırılmıştır. Saflaştırılan proteinlerin ağırlıkları R-LCC1 ve R-LCC2 için sırasıyla 56 kDa ve 62 kDa olarak bulunmuş ve bu enzimler 600 nm’de lakkazlara özgü absorbansı vermedikleri için sarı lakkazlar olarak tanımlanmıştır. Aktivite üzerinde substrat etkisi incelendiğinde maksimum aktivitenin ABTS için izlendiği ve bu substrat kullanıldığında optimum pH 3.0 olarak belirlenmiştir. Optimum sıcaklıklar R-LCC1 ve R-LCC2 için sırasıyla 60ºC ve 30ºC olarak belirlenmiş olup, LCC1’in termal stabilitesinin 30ºC’de daha iyi olduğu ve yarılanma ömrünün de 7 saatten fazla olduğu saptanmıştır. Saflaştırılan enzimler üzerinde sodyum azid, L-sistein ve SDS’nin inhibe edici etkisi olduğu görülmüş olup, enzimlerin katalitik özellikleri de hem ABTS hem de DMP substratları kullanılarak tespit edilmiştir.

Laccases are blue multi copper oxidases catayzing the oxidation of aromatic compounds, coupled with reduction of oxygen to water. Interest in these essentially ecofriendly enzymes continue to grow with their broad spectrum of applications. Identification, heterologous expression and characterization of two new laccases, lcc1 and lcc2, from white rot fungus Pycnoporus sanguineus MUCL 38531 have been firstly reported by this research. Screening of the laccase specific sequences on the genome of the white-rot fungi Pycnoporus sanguineus revealed two different laccase genes, designated as lcc1 and lcc2. Isolated full-length cDNAs were cloned into the yeast shuttle expression vector pPICZB with their own secretion signal sequences and overexpressed in methylotrophic yeast Pichia pastoris. Factors influencing the expression such as nutrients, methanol and copper concentrations were investigated. Recombinant laccase was purified to electrophoretically homogenous state by ammonium sulphate precipitation, anion exchange and size exclusion chromatography. The molecular weight of purified laccases were estimated about 56 kDa and 62 kDa for R-LCC1 and R-LCC2 respectively and they have categorized as yellow laccases due to lack of typical absorbance at 600 nm. Among tested compounds for substrate specificity, the maximum activity was observed for ABTS with pH optima 3.0. Although optimum temperatures were found as 60ºC and 30ºC, the thermostability was better at 30ºC with a half-life of more than 7 hours for LCC1. Sodium azide, L-cysteine and SDS were found as usual inhibitors for the purifed enzyme. The catalytic properties of the recombinant enzymes were also determined for both ABTS and DMP substrates.