Microalgae Immobilization And Applications

Abstract

Mikroalgler deniz ve tatlı su ortamlarında yaşayan tek hücreli, mikroskobik canlılardır. Gerek doğal ortamında bulunan gerekse laboratuvar koşullarında kültürü yapılabilen alglerin önemi büyüktür. Alg üretimi günümüzde ötrofikasyon kontrolü, atıksu arıtımı ve güneş enerjisinin biyokütleye dönüştürülmesinde en etkili ve ekonomik yoldur. Mikroalgler fazla CO2’i uzaklaştırarak ortamın pH’sını ayarlar ve ortamdaki fazla nutrientin uzaklaştırılmasıyla su kalitesinin kontrolüne yardımcı olmaktadırlar. Biyoteknolojik çalışmalarda mikroalglerin tercih edilme nedenleri; biyoteknolojik işlemlerden geçirilme kolaylıkları, maliyetlerinin düşük olması ve çevresel faktörlere direnç göstermeleri olarak özetlenebilir. Ancak serbest alg hücrelerinin küçük boyutları biyoteknoloji alanındaki kullanımlarda problemler ortaya çıkartmaktadır. Bu nedenle hücre immobilizasyon teknikleri geliştirilmiştir. İmmobilize edilmiş algler yüksek değere sahip ürünlerin üretiminde (agar,karragen, alginik asit vb.), azot ve fosfor ile metal ve toksik organik maddelerin gideriminde, mikroalglerin depolanmasında ve biyosensör geliştirmede kullanılmaktadır . Bu çalışmada bir deniz mikroalg türü olan Phaeodactylum tricornutum (Bohlin, 1897) hücreleri farklı konsantrasyonlarda hazırlanan sodyum alginat (%2.5, 3.5 ve 5) jel içine hapsedilmiş ve %2 ve 4’lük katyon solusyonunda (CaCl2) jelin sertleşmesi sağlanmıştır. Farklı kombinasyonlarda alginat ve katyon çözeltileri kullanılarak hazırlanan ve jel içine hapsedilen alglerin gelişimi ile kürelerin çapları kısa ve uzun vadeli olarak takip edilmiş ve birbirleri ile karşılaştırılmıştır. Eş zamanlı olarak serbest alglerin gelişimi de incelenerek immobilize ve serbest kültürlerin kıyaslaması yapılmıştır. Optimum koşulları tespit edilen küreler daha sonra toksisite deneyleri ve nutrientin hücre içine alımı çalışmalarında kullanılmıştır. Kısa vadeli deneylerde; %2.5, 3.5 ve 5 sodyum alginat konsantrasyonu ile %2 ve 4 katyon solusyonu kullanılarak hazırlanan jeller, 15 gün süre ile küre stabilitesi ve jel içine hapsedilen alg hücrelerinin gelişimi bakımından kıyaslanmıştır. Buna göre %2.5 alginat konsantrasyonuna sahip küreler, alg hücrelerinin gelişimi bakımından daha uygun bulunurken, %5’lik hazırlanan sodyum alginat jelin daha stabil olması sebebiyle alg gelişimine izin vermediği görülmüştür. Bir sonraki aşamada, %3.5 sodyum alginat konsantrasyonu kullanılarak hazırlanan küreler, %2 ve 4 katyon solusyonları içerisinde sertleştirilerek alglerin gelişimi ve jelin stabilitesi bakımından incelenmiştir. %2 ve 4 katyon solusyonu kullanılarak hazırlanan jellerde hücre gelişimi bakımından belirgin bir farklılık olmazken, buna karşılık %4 katyon solusyonunda hazırlanan kürelerin daha stabil olduğu gözlenmiştir. 15 günlük deney sonucunda %4’lük katyon solusyonunda hazırlanan küreler %24 küçülme gösterirken, %2’lik katyon solusyonunda hazırlanan kürelerde bu oran %35 olarak bulunmuştur. Elde edilen sonuçlar doğrultusunda, en uygun alginat konsantrasyonu (%3.5) ve katyon solusyonu oranı (%2 ve 4) seçilerek hazırlanan immobilize alg küreleri uzun süreli deneylerde kullanılmıştır. Uzun vadeli deneylerde; %2 ve 4 katyon solusyonunda sertleştirilen %3.5 sodyum alginat konsantrasyonuna sahip küreler kullanılmıştır. 255 gün süre ve 15 gün ara ile 7 günlük aşılama yapılarak, jel içine hapsedilen alg hücrelerinin gelişimi ve kürelerin stabilitesi incelenmiştir. Ayrıca 365 günlük inkübasyon süreci sonunda hücrelerin gelişimi ve küre stabilitesi ölçülmüştür. Deneyin ilk 30 günlük kısmında, %2 katyon solusyonu kullanılarak hazırlanan alg küreleri yaklaşık olarak 100000-125000 arasında hücre sayısına ulaşırken, %4’lük katyon solusyonunda hazırlanan kürelerde bu rakam 18000-35000 arasında kalmıştır. Alglerin büyüme hızı, depolanma süresi arttıkça (her 7 günlük inokulasyon sonunda) gitgide azalan bir eğilim göstermiştir. %4 katyon solusyonunda hazırlanan %3.5 alginat konsantrasyonuna sahip kürelerin hücre sayısı 60 günün sonunda sabit bir değere ulaşıp hemen hemen aynı kalırken, %2 katyon solusyonunda hazırlanan kürelerde hücre sayısı azalarak devam etmiş ve 157 gün sonra daha yüksek değere ulaşmıştır. 365 gün sonunda kürelerin canlılığını kaybettiği görülmüştür. İki farklı katyon solusyonu (%2 ve 4) kullanılarak hazırlanan alg kürelerinin çapı yaklaşık 4mm ölçülmüş ve kürelerin çapı arasında belirgin bir farklılık bulunmamıştır. Bu çalışma sonunda %3.5 alginat konsantrasyonu ve %2 katyon solusyonu seçilerek hazırlanan küreler toksisite deneyinde ve nutrientin hücre içine alımı çalışmalarında kullanılmıştır. Toksisite deneylerinde önemli çevresel kirleticilerden olan iki farklı PAH (Phenantrene ve Acenaphtene) kullanılarak immobilize algler ve serbest alg kültürleri ile bakteri (Vibrio fischeri, Biotox TM Kit) üzerindeki etkisi araştırılmıştır. 3 farklı konsantrasyonda Phenantrene (100, 400 ve 1000 µg/L) ve Acenaphtene (500, 1000 ve 1500 µg/L) kullanılmıştır. Buna göre, Vibrio fischeri ile yapılan deneyde EC20 değeri hesaplanırken, EC50 değeri belirlenememiştir. Alg toksisite deneylerinde farklı sistemler kullanılmıştır. Serbest alg kültürleri 10 gün süre ile Phenantrene (100, 400 ve 1000 µg/L) ve Acenaphtene (500, 1000 ve 1500 µg/L) kirleticilerine maruz bırakılarak davranışları gözlenmiştir. Serbest algler üzerinde Phen’in ilk konsantrasyonu (100 µg/L) ile kontrol grubu arasında belirgin bir fark görülmemiştir. Diğer Phen konsantrasyonlarının (400 ve 1000 µg/L) etkisi latent ve logaritmik dönemde gözlenmiştir. Ace konsantrasyonu arttıkça hücrelerin gelişimini engellediği ortaya çıkmıştır. Bir sonraki aşamada, serbest ve immobilize alg hücreleri 4 gün süre ile Phen ve Ace konsantrasyonlarına maruz bırakılarak gelişimleri incelenmiştir. Yapılan deneyler sonucunda, immobilize edilmiş alglerin duyarlı olmadığı görülmüştür. İmmobilizasyon tekniği, jel içine hapsedilen algler üzerinde koruyucu etki sağlamıştır. Fakat bakteri ile kıyaslandığında daha yüksek duyarlılığa sahip olduğu gözlenmiştir. Elde edilen sonuçlar kullanılarak Phen ve Ace için doz-cevap eğrisi çizilmiştir. Nutrient (NO3-N, PO4-P)’in küre içine hapsedilen algler tarafından hücre içine alımı çalışmaları kesikli sistemlerde denenmiş ve küreler birbirini izleyen dört uygulamada kullanılmıştır. Nitrat alım miktarı ilk uygulamada %31, daha sonra sırası ile ikinci, üçüncü ve dördüncü uygulamalarda artarak devam etmiştir (%51, 69 ve 75). Buna karşılık, net fosfat alım miktarı ilk üç uygulamada artarak devam ederken dördüncü uygulamada azalma göstermiştir (%3, 41, 74 ve 48). Sodyum alginat jel içine hapsedilen alg hücrelerinin, jel içinden medyuma taşması sebebiyle her uygulama 4 günde sonlandırılmıştır. Alg küreleri medyumdan kolayca ayrılabilmesi sebebiyle başka arıtımlarda da yeniden kullanılmıştır. Özetle, P. tricornutum hücreleri kullanılarak hazırlanan küreler için hücre gelişimi ve jel stabilitesi bakımından en uygun koşullar bulunmuştur (%3.5 Na-alginat konsantrasyonu ve %2 CaCl2 solusyonu). Kürelerin toksisite deneyleri ve nutrientin (N ve P) hücre içine alımı çalışmaları için uygun olduğu görülmüştür.

Microalgae are unicellular microscopic creatures living in the seas and fresh waters. Algae are very important for the environment and they exist both in their natural environment and can be produced in the culture medium under laboratory conditions. Algae production is the most efficient and economic way for controlling eutrophication, wastewater treatment and transforming the sun’s energy into biomass. The micro algae eliminate excess CO2 and in this way adjust the pH degree of the environment and they also help to control the water quality by removing excess nutrients from any environment. The reason why micro algae are preferred in bio-technologic studies is that they can increase their weight by approximately two times a day; they are easily processed in bio-technologic processes; they are low cost and they can resist to environmental factors. However since the free algae cells are relatively small, problems arise when they are used in the field of bio-technology. For that reason, cell immobilization techniques have been developed. The immobilized algae are used in the generation of those products having a high value (agar, carrageenan, and alginic acid), in the removal of nitrogen, phosphorus, metals and toxic organic substances, in the storage of micro algae and in the development of bio-sensors. In this study, the cells of Phaeodactylum tricornutum (Bohlin, 1897) as microalgae species of the seas were confined in the sodium alginate solution prepared in different concentrations (2.5, 3.5 and 5%) and they were left to harden in the cation solution of 2% and 4%. Then the development of algae that had been immobilized in gels prepared by using different combinations of alginate and cation solutions and the diameters of the beads was monitored and compared with each other in short and long term. At the same time, the development of free algae was monitored and a comparison was made between the immobilized algae and free cultures. Then the beads that were determined in optimum conditions of both algae growth and gel stability. In short term experiments, the gels prepared by using sodium alginate concentration of 2.5, 3.5 and 5% and cation solutions of 2 and 4% were compared in terms of the development of algae cells and stability of the beads for a period of 15 days. As a result it was found out that the ratio of alginate concentration of 3.5% was better for the development of algae cells confined in gel and that the gel of sodium alginate of 2 and 4% were used. Consequentially, the immobilized algae prepared by using the proper alginate solution concentration (3.5%) and cation solution concentration (2% and 4%) were used in experiments with long term experiments. In long term experiments, the beads prepared by using a sodium alginate concentration of 3.5% and cation solution of 2% and 4% were used. Inoculation was made during 7 days for a period of 255 days and with intervals of 15 days and after that, the development of algae cells confined in gel and stability of the beads were examined. In addition to these examinations, cell development and beads stability was measured following an incubation process of 365 days. While the number of the cells from the beads of 3.5% prepared in a cation solution of 4% reached a stabile value and remained nearly same at the end of 60 days, the number of the cells from the beads of 3.5% prepared in a cation solution of 2% continued to increase at a slower rate and cell number reached a higher value at the end of 157 days. After a year, the microalgae in the beads were almost lost their viability. The diameter of algae cells prepared by using two different cation solutions (2% and 4%) was measured as approximately 4mm and no apparent difference was found in the diameter of the cells. The results of this study were used in toxicity tests and nutrient removal studies by using an alginate solution of 3.5% and a cation solution 2%. The sensitivity of PAH species selected as toxic substance (Phenantrene and Acenaphtene) and of the algae confined in the bead were measured and their reaction to the toxic substance was compared by carrying out synchronous studies on the bacteria (Vibrio fischeri, Biotox TM Kit) and free algae cultures. As a result, no apparent difference was observed on the free algae when the initial concentration of Phen (100 μg/L) and the control group was compared. The effect of other Phen concentrations (400 and 1000 μg/L) was also observed during the latent and logarithmic periods. It was found out that higher concentrations of Ace (500, 1000 and 1500 µg/L) better inhibited the cell development. Then dose-response curve was drawn for Ace and Phen by using these results. Nutrient (NO3-N, PO4-P) uptake studies were carried out in non-continuous systems and the beads were used in four successive applications. In the first application, the net nitrate uptake ratio was determined to be higher when compared to phosphate. The nitrate uptake ratio was determined to be 31% in the first application and it continued to increase in the second, third and fourth applications (51%, 69% and 75% respectively). However, while the net phosphate uptake quantity continued to increase in the first three applications, it showed a reduction in the fourth application (3%, 41%, 74% and 48% respectively). All applications were terminated after four days because sodium alginate gel started to break up after the fourth day and the cells were released to the medium that was isolated from the gel. As a result of these studies, it was found out that alginate beads used in non-continuous systems were better for nitrate uptake when compared to phosphate uptake. Besides that algae cells were not released the beads during treatment. For that reason, they are used again in other treatments since they can easily separate from the treated medium. In summary, beads prepared using 3.5% Na-alginate concentration and 2% cation solution (CaCl2) were found to be the most stable and suitable to P. tricornutum cells. The study shows that algal beads are efficient for toxicity experiments and nutrient (N and P) uptake.