Effect of pre-concentration technique on the extraction of volatile compounds in beef and changes in quality parameters under dynamic storage conditions

Abstract

Çiğ kırmızı et, mikroorganizmalar ve kimyasal/biyokimyasal reaksiyonlar için uygun bir besin kompozisyonuna sahiptir. Et bileşimi yaklaşık olarak %75.0 su, %18.5 protein, %3.0 yağ, %1.0 karbonhidratlardan ve geri kalan eser oranda da inorganik bileşenlerden oluşmaktadır. Bu sebeple, uygun muhafaza koşulları altında korunmayan çiğ etler çok hızlı bozulabilir ürünler arasında yer almaktadır. Mikrobiyal gelişim ve enzimatik oksidasyon reaksiyonları etin bozulmasından sorumlu iki ana mekanizmadır. Yağ oksidasyonu sebebiyle acılaşma ve kırmızı renkte kahverengileşme meydana gelmekle birlikte, mikrobiyal aktivitenin bozulma üzerindeki payının oksidasyondan daha baskın olduğu söylenebilmektedir. Glukoz, metabolik izyolu üzerinde kullanılan ilk substrat madde olup, laktat ve amino asitler ikincil ve üçüncül enerji kaynakları olarak kullanılmaktadır. Substrat maddelerin mikrobiyal aktivite ile kullanılması sonucu bazı ön maddeler istenmeyen metabolitlere dönüştürülmektedir. Kötü koku ve gaz oluşumu, ekşime, yapışkan yüzey oluşumu, renk değişimi, pH değişimi ve yapısal bileşenlerin bozulması gibi problemler mikrobiyal gelişim sonrası meydana gelen değişikliklerdir. Etin tazelik seviyesini hızlı bir şekilde tayin etmek, tüketiciler için zor olabilmektedir. Bu noktada, taze ürünün atık olarak atılması veya tersi bir şekilde taze olmayan etin kullanımı söz konusu olabilmektedir. Ev tipi soğutuculardaki sıcaklık set değerleri, soğutucu kapısını açıp kapama alışkanlıklarına göre tüketici davranışları çeşitlilik göstermekle birlikte, kötü kullanımdan kaynaklı sıcaklık dalgalanmaları altında ette kalite kayıpları kaçınılmazdır. Etin tazelik durumunun sensör gibi hızlı ve hasarsız yöntemler ile belirlenerek tüketiciyi bilgilendirmek, günümüzde artan alternatif araştırma alanları arasındadır. Ortamdaki uçucu bileşenlerin güvenilir bir şekilde ölçülmesi, kesinliği ve doğruluğu yüksek sensörlerin geliştirilmesi için önemlidir. Sensörlerin geliştirilmesi evresinde evsel kullanım şartlarını da simüle edebilmek amacıyla hem stabil saklama sıcaklığı hem de sıcaklık dalgalanmasının yüksek olduğu şartların incelenmesi gereklidir. Ek olarak, uçucu bileşenlerin ön-konsantrasyon basamağında etkin olarak ekstrakte edilmesi de farklı gıda yapıları için araştırılmalıdır. Et ve et ürünlerinde mikrobiyal bozulma sonucunda çeşitli metabolitler meydana gelmekle birlikte bunların önemli bir bölümünü aldehitler, ketonlar, alkoller, esterler, yağ asitleri, sülfürlü bileşikler, alifatik ve aromatik uçucu organik bileşenler oluşturmaktadır. Bu metabolitlerin oluşturduğu kötü koku ve aroma değişimi sebebiyle uçucu organik bileşenlerin de bir kalite göstergesi olarak kullanılması önemli hale gelmektedir. Et ve et ürünlerinde uçucu organik bileşenlerin belirlenmesi için yaygın kullanılan teknikler bulunmaktadır. Bu teknikler; gaz kromatografisi-kütle spektroskopisi (GC-MS), gaz kromatografisi-foton iyonizasyon dedektörü (GC-PID), seçilmiş iyon akış tübü kütle spektrometresi (SIFT-MS), proton transferi reaksiyon kütle spektrometresi (PTR-MS) ve elektronik burun olarak sıralanabilmektedir. Dinamik tepeboşluğu (DHS) ve katı faz mikroekstraksiyonu (SPME) ise en yaygın araştırılan ön-konsantrasyon teknikleri olup, geniş spektrumda uçucu bileşenleri tanımlayabilmektedir. Bu tez çalışması iki ana kısımdan oluşmaktadır. Çalışmanın ilk kısmında, kontrollü bir hacim içerisinde, 4ºC'de muhafaza edilen kırmızı etten açığa çıkan uçucu bileşenlerin, iki farklı ön-konsantrasyon tekniği ile üç farklı yük faktöründe (örnek miktarı: tepe boşluğu hacmi) incelenmesi hedeflenmiştir. Çalışma kapsamında irdelenen iki farklı ön-konsantrasyon yöntemi: 1) Vial içinde tepeboşluğu-katı faz mikroekstraksiyonu tekniği, 2) Kontrol hacminde Tenax tüp üzerine gaz ile süpürme tekniği. Tenax tüp üzerine gaz ile süpürme tekniği bu tez kapsamında et uçucuları için ilk defa denenen bir yöntemdir. Bu ön konsantrasyon basamakları ile bütünleşik olarak, uçucu bileşen analizleri için sırasıyla GC-MS ve Isıl Ayrıştırmalı-GC-MS sistemleri kullanılmıştır. Etin muhafaza edildiği kontrol hacminin tepe boşluğunda biriken uçucu bileşenler ile adsorbe edici maddenin etkileşimi, maddenin kısmi basınç ve uçuculuk özelliklerindeki değişimlere bağlı olduğu için ürün miktarından etkilenmektedir. Ek olarak, farklı adsorban maddelerin ayırt etme kapasitesi uçucu bileşiğin yapısından kaynaklanan değişkenliklerden de etkilenmektedir. Her iki ön-konsantrasyon basamağı için etkisi incelenen üç farklı yük faktörü; 0.025 kg/L, 0.05 kg/L ve 0.10 kg/L olarak seçilmiştir. Her iki ön-konsantrasyon tekniği de alkol, aldehit ve keton gruplarından benzer yapılarda uçucu organik bileşikleri tepeboşluğundan ekstrakte edebilmiştir. Yükleme faktörü hem katı faz hem de Tenax adsorbantları için ekstraksiyon etkinliğini önemli seviyede etkilemiştir. Bununla birlikte, aminler sadece Tenax ile ölçülürken, ester gruplarından etil asetat sadece katı faz mikroekstraksiyon (SPME) yöntemi ile tespit edilebilmiştir. En iyi ekstraksiyon için optimum yükleme faktörü uçucu bileşenin türüne göre değişmekle birlikte, her iki ön-konsantrasyon tekniği için de genel olarak 0.05 kg/L'lik yükleme faktörü, toplam pik alanlarına göre de değerlendirildiğinde en etkili ekstraksiyonu sağlamıştır. Katı faz mikroekstraksiyon yönteminde durgun denge şartları söz konusu olduğu için uçucu bileşenler arasındaki rekabetin daha belirgin olduğu gözlenmiştir. Buna bağlı olarak da yüksek nem içerikli tepe boşluğu koşullarında katı faz mikroekstraksiyonunun, yüksek yük faktörlerinde ekstraksiyon veriminde azalmaya sebep olduğu düşünülmektedir. Gaz ile Tenax tüp üzerine süpürme tekniğinde zorlanmış taşınımın etkili olduğu ve tanımlanan uçucu analitlerin geri kazanımının daha yüksek olduğu belirlenmiştir. Geri kazanım analizlerine göre, Tenax yönteminde %70-%110 aralığında geri kazanım elde edilerek, daha sonraki aşamada bu yöntemin kabul edilebilir bir yöntem olarak kullanılabileceği belirlenmiştir. Uçucu bileşenlerin tespit edilen toplam pik alanları kıyaslandığında, katı faz mikroekstraksiyon tekniği ile 0.05 kg/L yük faktörü için ~290x106 AU pik alanı elde edilirken, Tenax tüpü üzerine gaz süpürme tekniği ile aynı yük faktörü için ~390x106 AU ile daha yüksek pik alanı elde edilmiştir. Çalışmanın ilk basamağında elde edilen bulgulara göre, tezin ikinci aşamasındaki uçucu bileşen analizleri için gaz ile Tenax tüp üzerine süpürme ön-konsantrasyon basamağı ile birleştirilmiş ısıl ayrıştırmalı-GC-MS analiz sisteminde 0.05 kg/l yük faktörü ile devam edilmiştirr. Tenax tüpler ile ekstraksiyon yönteminin gelecekteki çalışmalada farklı gıda maddeleri için detaylı olarak araştırılacak yöntemler arasında yerini alacağı düşünülmektedir. Çalışmanın ikinci aşamasında, ev tipi soğutucu kullanım profilini simüle edebilecek iki farklı muhafaza sıcaklığında (ortalama sıcaklık 0°C ve 4°C) izotermal ve izotermal olmayan (dinamik) koşulların yaratılarak, çiğ ette bozulmaya bağlı olarak ortaya çıkan uçucu bileşiklerin karakteristiğinin incelenmesi ve diğer kalite metrikleri ile ilişkilendirilmesi hedeflenmiştir. İzotermal olmayan koşulların etkisi iki farklı dinamik sıcaklık profili kullanılarak incelenmiştir. İki izotermal olmayan koşula ait şartlar; 1) soğutucu kapı açma-kapama sıklığı 15 dakika, soğutucu kapısı açık kalma süresi 15 saniye, 2) soğutucu kapı açma-kapama sıklığı 30 dakika, soğutucu kapısı açık kalma süresi 15 saniye olarak ayarlanmıştır. Veri analizleri ve verilerin sınıflandırılma aşamaları için temel bileşen analizi (PCA), diskriminant analizi, kısmi en küçük kareler regresyonu (PLS-R), genel lineer model (GLM) ve pearson korelasyonu analizlerinden faydalanılmıştır. 0˚C muhafaza sıcaklıklığında, genel tüketilebilirlik değerlendirmesine göre tüm koşullar için 4˚C koşullarına göre daha uzun raf ömrü değerleri elde edilmiştir. 4˚C, ve 0˚C izotermal olmayan koşullarda genel tüketilebilirlik değerleri, izotermal koşullara göre sırasıyla 24 saat ve 72 saat sonra yüksek oranda düşüş göstermiştir. 7 günlük muhafaza süresi içerisinde 0˚C şartlarında uçucu bileşenler, bozulma sürecinin yavaşlatılması sebebiyle 4˚C şartlarına kıyasla daha az sayıda ölçülmüştür. Ek olarak, iki izotermal olmayan koşul arasındaki farklılık 0˚C koşullarında daha belirgin olarak ayırt edilebilmiştir. 2,3-butandion, 3-hidroksi-2-butanon ve 1-pentanol bozulma periyodunda önemli seviyede artış göstermiş olup, dinamik muhafaza koşullarında da belirgin olarak değişimleri izlenebilmiştir. Temel bileşen analizi (PCA) sınıflandırma tekniğine göre; 2,3-butandion, 3-hidroksi-2-butanon, 1-pentanol, 2-pentanon ve 3-metil-1-butanal 0˚C ve 4˚C muhafaza şartları için ortak bozulma indikatörü olarak değerlendirilebilmektedir. Diskriminant analiz tekniğinin, GC-MS verileri ile etteki taze, yarı-taze ve bozulmuş durumlarının sınıflandırılması performansında temel bileşen analizleri ile uyumlu göstergeler sunduğu belirlenmiştir. Kısmi en küçük kareler regresyonu (PLS-R) tahminleme modeli ile uçucu bileşenlerin zamana bağlı değişim verileri kullanılarak, diğer kalite metriklerini (mikrobiyolojik, duyusal, renk ve oksidasyon ölçümleri) tahminleme gücü değerlendirilmiştir. Pseudomonas spp. sayısının PLS-R modeli kullanılarak GC-MS verileri ile tahminleme performansının diğer metriklere kıyasla daha yüksek olduğu belirlenmiştir. Pseudomonas spp. sayısı için PLS-R tahminleme modeline göre, tahminlenen hata (log), 0ºC ve 4ºC koşulları için mimimum ve maksimum olarak belirtilen 0.5 ve 1.5 log sınır değerleri arasında homojen olarak dağılım göstermiştir. Tüm datanın %70.83 oranında sınır değerler arasında kaldığı ve bu oranın kabul edilebilir düzeyde olduğu tespit edilmiştir. Belirtilen koşullar altında, ette Pseudomonas spp. sayısı uçucu bileşen analizi ile tahmin edilebilmektedir. Diğer kalite metrikleri için yapılan PLS-R modeli analizlerine göre tahminleme kalitesinin yeterince yüksek olmadığı gözlenmiştir. Pearson korelasyon katsayısı hesaplamalarına göre, 0ºC ve 4ºC koşulları için hekzanal'ın, tiyobarbutirik asit (TBA) değerleri ile herhangi bir ilişkisi olmadığı beklenmedik bir sonuç olarak elde edilmiştir. Hue açısı (°) ve TBA değerlerinin, genellikle muhafaza sonunda ortaya çıkan ester bileşenleri ile 0.900 katsayı değerinde yüksek pozitif korelasyon gösterdiği belirlenmiştir. 4ºC muhafaza koşulları için 2-butandione, 3-hydroxy-2-butanone ve 1-pentanol uçucu bileşikleri ile genel tüketilebilirlik değerleri arasında çok güçlü negatif korelasyon tespit edilmiştir. Bu korelasyon katsayıları sırası ile -0.761, -0.911 ve -0.830'dir. 0°C muhafaza şartlarında ise genel tüketilebilirlik puanları ile 2-butandione, 3-hidroksi-2-butanon, 2-heptanon, 1-pentanol, 3-metil-1-butanol, 1-okten-3-ol, 2-etil-1-hekzanol ve 1-hekzanol uçucuları arasında katsatyısı -0.700 - (-)0.900 arasında değişen yüksek negatif korelasyon belirlenmiştir. Bu uçucu bileşenlerin genellikle mikrobiyal gelişim kaynaklı olduğu düşünüldüğünde, genel tüketilebilirlikteki değişimlerin temel olarak mikrobiyal değişim kaynaklı olduğu söylenebilmektedir. Hue açısı parametresinde istatistiksel olarak önemli bir değişim gözlenmediği için herhangi bir uçucu bileşen ile ilişkisi kurulamamıştır. Bu tez çalışmasına konu olan araştırmanın kapsamı, farklı et veya gıda türleri için başlangıç pH seviyesi, yağ oranı, orijini gibi farklı iç faktörlerin ve farklı sıcaklık aralıkları ve ambalajlama yöntemleri gibi dış faktörlerin etkisi de dahil edilerek yaygınlaştırılabilir. Bu çalışmanın benzer araştırma analojisi, bozulmanın hızlı tayin edilmesi amaçlı kullanılacak spektroskopik, kolorimetrik ve çeşitli sensör ölçüm teknikleri için de kurulabileceği düşünülmektedir.

Fresh raw meat present excellent nutrient composition for microorganisms and chemical/biochemical reactions. Meat approximately contains 75.0% water, 18.5% protein, 3.0% lipids, 1.0% carbohydrate and 1.0% inorganic material. Therefore, raw meat is one of the most perishable foods if it is stored under improper storage conditions. Microbial growth and enzymatic oxidation reactions are the main two mechanisms responsible for spoilage of meats. Rancidity and browning of red color are seen due to the lipid oxidation. Microbial activity on spoilage is more dominant than oxidation reactions for fresh beef. Glucose is the first substrate used in the metabolic pathway; lactate and amino acids are metabolized as second and third energy sources. As a consequence, of spoilage reactions, undesirable metabolic by-products are produced. Off-odor and gas formation, souring, slime formation on the surface, discoloration, pH changes and decomposition of the structural components are observed after microbial growth. Microbial spoilage in meat product causes production of various volatile organic compounds (VOCs) such as aldehydes, ketones, alcohol, esters, fatty acids, sulphur compounds, aliphatic and aromatic compounds. Besides spoilage, these compounds play an important role for the production of off-odors and off-flavors. These undesired changes make the detection of VOCs an obligatory. Some common techniques are currently being used for the determination of VOCs in meat and meat products. These techniques are gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS), gas chromatography-photon ionization dedector (GC-PID), selected ion flow tube mass spectrometry (SIFT-MS), proton transfer reaction-mass spectrometry (PTR-MS) and electronic nose etc. Dynamic headspace (DHS) and solid phase microextraction (SPME) are most commonly used pre-concentration methods for detection of VOCs because of their simplicity and rapidness. They can identify very wide range of volatile compounds. This thesis consists of two main sections. In the first section of the study, it was focused on the effect of loading factor (sample amount: total volume ratio) in the container where meat samples stored by comparing the two pre-concentration techniques: Headspace (HS)-Solid Phase Microextraction (SPME) and gas flushing on Tenax tube. GC-MS and thermal desorber (TD)-GC-MS systems were used for further analysis of volatile organic compounds. The interaction of volatiles in headspace with adsorbent fiber is dependent on the amount of product in a specified volume due to the changes in the partial pressure and volatility of analytes. Additionally, differentiation quality of different adsorbent is possible due to the variety in chemical structure of volatiles. Three different loading factors such as; 0.025 kg/L, 0.05 kg/L and 0.10 kg/L were studied. Both of two preconcentration techniques identified similar volatile organic compounds in the group of alcohols, aldehydes and ketones compounds. Loading factor affected the extraction efficiency both on fiber and Tenax significantly. However, while amines were measured only with Tenax, ethyl acetate was only detected with SPME method. Optimum loading factor for the best efficient extraction method depended on the type of the volatile compound. In general, loading factor of 0.05 kg/L was regarded as the most efficient extraction factor for both pre-concentration techniques for most of the volatiles and according to the total peak areas. It was noticed that the competitiveness was more existing in SPME due to the stationary conditions. Related with this, humid headspace may be a problem for SPME especially at high sample amounts. Higher recovery of analytes was obtained by thermal desorber-tenax sampling for all studied loading factor due to the forced flushing of the all headspace. The average recoveries with gas flushing on Tenax were between 70%-110% accepted as suitable for further analysis. It was continued with gas flushing on Tenax tube sampling technique coupled with TD-GC-MS identification system for the second part of the study and loading factor was selected as 0.05 kg/L based on the findings. The application of Tenax sampling method for volatile analyses of meat can be extensively studied in future works. In the second part of the study, the volatile organic compound profile released from beef meat under the effect of isothermal and non-isothermal cold storage conditions of two temperatures, simulating the domestic conditions were investigated. Non-isothermal conditions such as 15 min. and 30 min. intervals between cooler door open-close cycles at two temperatures (0°C and 4°C) were studied. Fresh beef samples stored under aerobic conditions were monitored by analytical methods, and several volatile compounds found to be possible chemical indicators. Temperature fluctuations affected the intensity of some indicative volatiles significantly, parallel to off-odor development. Two different non-isothermal conditions mostly differentiated at 0°C storage temperature. Especially, 2,3-butandione, 3-hydroxy-2-butanone and 1-pentanol could be used as indicative volatiles for different cold storage conditions according to the statistical analysis. For qualitative analysis of data, principal component analysis (PCA) classification method was applied to all GC-MS data by using sensory scores as predictors. 2,3-butandione, 3-hydroxy-2-butanone, 1-pentanol, 2-pentanone, 3-methyl-1-butanal were classified as common indicators of spoilage both for 0°C and 4°C conditions in PCA analysis. Discriminant analysis was also used for classification performance of GC-MS data on shelf life prediction as fresh, semi-fresh and spoiled state. Discriminant analysis were in consistence with PCA results. For further quantitative analysis, partial least square regression (PLS-R) prediction models were applied for estimation of all quality parameters by using GC-MS volatile compounds data. Pseudomonas spp. counts were predicted well with GC-MS data using PLS-R model compared to other analytic parameters. Based on the PLS-R prediction model, predicted errors (log) distributed homogenously between 0.5 and 1.5 log (accepted range) with %70.83 (accepted percentage should be above 70% for good prediction) of all data both for 0°C and 4°C storage temperatures for Pseudomonas spp. counts. Correlations between all quality parameters gave also a good approach for the identification of indicators. According to pearson correlation coefficients, hexanal did not show any relationship with thiobarbutyric acid (TBA) value unexpectedly both for 0°C and 4°C. Hue angle (°) together with TBA value showed very high correlations around 0.9 with ester compounds that formed at the end of the storage period. There was a strong negative correlation between overall acceptability scores and 2-butandione, 3-hydroxy-2-butanone and 1-pentanol volatiles with high coefficients of -0.761, -0.911 and -0.830, respectively for 4°C storage condition. For 0°C storage temperature, there was a strong correlation of overall acceptability with 2-butandione, 3-hydroxy-2-butanone, 2-heptanone, 1-pentanol, 3-methyl-1-butanol, 1-octen-3-ol, 2-ethyl-1-hexanol and 1-hexanol volatiles with high coefficients around 0.7-0.9. It shows that overall acceptability is mainly affected by microbial changes. Since no change was observed in hue angle parameter at 0°C, no linear relationship was observed with any of the volatile compounds. Qualitative and quantitative analysis of volatiles are needed for developing freshness/odour sensors in order to give advice about meat quality non-invasively in consumer level and to ensure both quality and safety. On the other hand, decreasing food waste is an indirect result of these sensors. The application of this study can support the "freshness sensor" development for domestic use and be extended to different conditions in future studies. Also for the food industry, freshness and safety of fresh meat are usually considered as the most important issues. Therefore, characterization and validation of the volatiles may be replaced with the traditional methods and these methods could be used as a new rapid tool for assessment of frehness and microbial spoilage of meats.