İnsan Nöral Kök Hücrelerinde Nfı Transkripsiyon Faktörlerinn, Nfıb Hedef Genlerinin Ve Nfıb Ekspresyonunu Düzenleyen Mirna'ların Karakterizasyonu

Abstract

Nükleer faktör I (NFI) transkripsiyon faktörü ailesi sinir sisteminin gelişimi sırasında gen ifadesinin önemli regülatörlerinden biridir. C.elegans ve Drosophilia genomunda tek bir NFI geni bulunurken, omurgalılarda N-ucu DNA bağlama bölgesi homolog olan dört farklı NFI üyesi (NFIA, NFIB, NFIC ve NFIX) vardır. Bunun yanı sıra NFI genlerinin basit prokaryot ve ökaryotların genomunda bulunmamasından dolayı metazoanlara özgü olduğu söylenilebilir. Ayrıca alternatif kesilim sonucunda her bir NFI proteinin pek çok izoformunun varlığı gösterilmiştir. Ancak izoformların NFI proteinlerinin fonksiyonlarına olan etkisi tam olarak bilinmemektedir. NFI proteinleri, hedef genlerinin promotor bölgelerinde bulunan palindromik TTGGC(N5)GCCAA dizisini tanıyarak çift iplikli DNA’ya N-ucu domeni aracılığıyla bağlanmaktadır. Bu nedenle N-ucu DNA bağlanma ve dimer oluşturma domeni olarak bilinmekte ve yaklaşık olarak 200-220 aminoasitten oluşmaktadır. Bu bölgede SMAD proteinlerinin DNA’ya bağlanmasında fonksiyonel olduğu bilinen Mad Homoloji 1 (MH1) domenini bulunmaktadır. MH1 domeni içindeki, NFI’larda korunmuş olan dört sistein aminoasidinden üçünün DNA’ya bağlanmada rol aldığı bilinmektedir. Bu domeninin bilinen diğer DNA bağlanma domenleri ile homolojisi bulunmamaktadır. C-ucu domeni ise transkripsiyonel aktivasyon/represyon domeni olarak bilinmektedir. N-ucu domeninde görülen homolojinin aksine, C-ucu domeni NFI izoformlarında farklılık göstermektedir. Bu bölgede yer alan ve sekansın ~ %25’ini oluşturan prolince zengin bölge NFI’ların fonksiyonunda önemlidir. NFI proteinleri arasında C-ucu domenindeki farklılıklaşmaya ek olarak, alternative kırpılma mekanizmaları da izoformlar arasındaki çeşitliliği artırmaktadır ve bu çeşitliliğin NFI izoformlarının farklı fonksiyonları gerçekleştirmesini sağlayabileceği düşünülmektedir. NFI’ların hücre ya da doku spesifik olarak gen ekspresyonunu: (1) promotorun metilasyon paternini değiştirmesi; (2) nükleozom yapısını değiştirmesi ve/veya RNA polimerazın bağlanmasını etkilemesi; (3) NFI ile rekabet edebilen farklı transkripsiyon faktörlerinin hedef dizisine bağlanmasının engellemesi; (4) genel transkripsiyon faktörleriyle etkileşmesi; (5) hücreye spesifik olarak koaktivatör/korepresörlerle etkileşmesi gibi beş farklı mekanizma yoluyla düzenlemektedir. Merkezi sinir sisteminde embriyonik dönemde NFIA, NFIB ve NFIX nöral progenitor hücrelerinin bulunduğu ventriküler bölgelerde, nöronlarda ve glialarda ifade edilirken, yetişkin dönemde ise nöral kök hücrenin ve projenitor hücrelerinin lokalize olduğu subventriküler zonda bulunmaktadır. NFIC ifadesinin ise düşük düzeylerde bulunması sebebiyle nöronal gelişimde önemli bir rol oynamadığı düşünülmektedir. In vivo çalışmalar sonucunda, bu genlerin ifadesinin susturulmasının, beynin farklı bölgelerinin (hipokampüs, neokorteks, arka beyin, gibi) gelişimini, farklı gelişimsel süreçlerde (nöronal farklılaşma, nörogenez, gliogenez, akzonal uzama ve hücre migrasyonu) etkilediği gösterilmiştir. NFI proteinleri tarafından transkripsiyonu aktive olan genler farklılaşma, gliogenez, dendrit ve akson oluşumu veya hücre taşınımı ile ilgili mekanizmlarda rol oynarken; transkripsiyonu represyona uğrayan genlerin kök hücrenin kendini yenilemesi veya projenitör hücrenin kendini sürdürmesi ile ilgili olduğu görülmüştür. Embriyonik kök hücrelerdeki işlevinin aksine, yetişkin kök hücrelerde NFI proteinleri farklılaşmayı sağlamak yerine kök hücrelerin çoğalmadan sessiz kalmasını ve/veya hayatta kalmasını teşvik etmektedir. NFI transkripsiyon faktörlerinin beynin farklı kısımlarında farklı fonksiyonları bulunmaktadır. Ön beyinde NFI’ların astrosit oluşumunda önemli olduğu bilinen GFAP geninin promotoruna bağlanarak ifadesini arttırdığı ve gliogenezi tetiklediği, bunun yanı sıra kök hücre yenilenmesini aktifleştirecek genlerin (EZH2, SOX9, HES1) ifadesini baskıladığı görülmüştür. Beyincik gelişiminde ise NFI’ların erken nörogenez sonrasındaki aşamalarda rol oynadıkları, akson ve dendrit oluşumu ile birlikte hücre migrasyonuyla ilişkili olan genlerin (TAG1, GABRA6, N-CAD, EPHRIN-B1, WNT7A) ifadesini kontrol ettikleri bilinmektedir. Omurilik gelişiminde, NFI proteinleri erken nörogenezde farklılaşmayı engelleyerek nöral prekürsör hücre sayısının artmasını sağlarken, geç nörogenez süresince astrosit oluşumu ile ilişkili genleri (GFAP, MMD2, APCDD1, ZCCHC24, GLAST, FGFR3) kontrol ederek gliogenez oluşumunu teşvik etmektedir. Buna ek olarak, NFI’lar ile oligodendrosit oluşumu ile ilgili olduğu bilinen OLIG2 transkripsiyon faktörünün ifadelerinin birbiri ile rekabet ettiği görülmüştür. Bu nedenle NFI proteinleri oligodendrit ve astrosit oluşumu arasındaki dengeyi sağlamaktadır. Daha önceki çalışmalarımızda, NFIA, NFIB ve NFIX proteinlerinin üçünün de arka beyindeki preserebellar sistemde ifade edildiği ve bu proteinlerden sadece NFIB ifadesinin yokluğunda preserebellar çekirdek nöronlarının gelişiminde azalma ve gecikme görülmüştür. Bu sebeple NFIB’nin arka beyin gelişimindeki rolünün nörogenez ile ilişkili olabileceği düşünülmektedir. Ön araştırmalarda, NFIB ifadesinin yokluğunda mRNA ekspresyon analizi yapılarak preserebellar nöroprojenitörlerde NFIB’nin hedef genleri tespit edilmiştir. Bu hedef genlerin içerisinden merkezi sinir sistemindeki fonksiyonları ve ekspresyonları sebebiyle üç hedef genin (CDO, FGF19, COL2A1) öncelikli olarak incelenmesi uygun bulunmuştur. Nörogenezde temel bir rolünün olduğu düşünülen CDO bir hücre membran proteinidir ve merkezi sinir sisteminde ventriküler bölgelerde ifade edildiği görülmüştür. CDO’nun beyin korteksinde sinyal kompleksi kurarak, bazik heliks-loop-heliks (Neurogenin-1) ve E protein (E47) heterodimerlerinin oluşumuna yol açıp, nöronal farklılaşmayı teşvik etmektedir. Ayrıca SHH yolağında koreseptör olarak da rol almaktadır. Büyüme faktörü ailesine ait olan FGF19 farede ifade edilen FGF15’in insanda ifade edilen formudur. FGF15’in beyin korteks gelişimi sırasında hücre çoğalmasını durdurarak nöronal farklılaşmayı tetiklediği ve hücre döngüsünü kısalttığı görülmüştür. COL2A1 ise hücrenin ekstra-hücresel matriksinin (ECM) oluşumunda rol oynayan bir proteindir. ECM proteinlerinin ifadesinin değişimi hücresel farklılaşmada önemli olduğu bilinmektedir. COL2A1’in merkezi sinir sistemi gelişiminde fonksiyonu bilinmemektedir. İlginç olarak, kondrosit gelişiminde NFIB’nin COL2A1 ekspresyonunu kontrol ettiği bulunmuştur. Bu tez kapsamında, H9 insan embriyonik kök hücre hattından elde edilen nöral kök hücrelerinin (Gibco) farklılaşması sırasında NFI transkripsiyon faktörleri ve hedef genlerin ekspresyonu karakterize edilmiştir. Nöronal farklılaşma sürecinde NFIA ve FGF19 ifadesinin arttığı görülürken; NFIB, NFIC, NFIX, CDO ve COL2A1 genlerinin ifadesinde önemli ölçüde azalma gözlenmiştir. Ayrıca, NFIB’nin ekspresyonunun protein düzeyinde de azaldığı tespit edilmiştir. Son zamanlarda yapılan çalışmalar miRNA’ların transkripsiyon sonrası düzenlemelerle merkezi sinir sistemi gelişimi sürecinde (hücre kaderinin belirlenmesinde, nöronal farklılaşma, kök hücre/projenitör hücrelerin proliferasyonunda ya da ölümü) rol aldığını göstermektedir. Nöronal farklılaşma sürecinde, NFIB’nin miRNA'lar tarafından post-transkripsiyonel düzenlemeye tabi tutulup tutulmadığını tespit edebilmek amacıyla, NFIB 3’UTR’ını hedeflediği düşünülen miRNA’lar belirlenmiştir. İnsan nöral kök hücrelerinin nöronal farklılaşması sırasında, seçilen miRNA’ların (miR-153, miR-30a, miR-124a, miR-92b, miR-130a ve miR-363) ekspresyon analizleri yapılmıştır. Bu analiz sonucunda da miR-153, miR-124a ve miR-30a ifadelerinin arttığı, miR-363 ifadesinin ise azaldığı bulunmuştur. Ekspresyon analizleri doğrultusunda, hücre farklılaşması sırasında ekspresyonları artan miRNA’ların NFIB 3’UTR’ına bağlanmasının NFIB’nin ifadesi üzerindeki etkisini belirlemek için bildirici gen (lusiferaz) analizi yapılmak istenilmiştir. Bu amaçla bu miRNA’ların NFIB 3’UTR’ındaki tahmini bağlanma bölgelerini içeren 4.5 kb kısmı, dört farklı bölüme ayrılıp (3’UTR_A, 3’UTR_B, 3’UTR_C ve 3’UTR_D) insan genomik DNA’sından çoğaltılarak pmiRGLO lusiferaz vektörüne klonlanmıştır. Ön veriler sonucunda miR-153 ve miR-124a’nın 3’UTR_D (6418-6425) ve 3’UTR_A (1842-1848) bölgeleri ile doğrudan etkileşime girerek NFIB’nin ifadesini kontrol ettiği bulunmuştur. Ayrıca, miR-153 ve miR-124a bağlanma bölgelerine özgü olarak yapılan mutasyon analizlerinin sonucunda, NFIB ifadesinin bu miRNA’lar tarafından spesifik olarak düzenlendiği tespit edilmiştir. Bizim çalışmamızla eş zamanlı olarak, fetal sıçan akciğer epitel hücrelerinin olgunlaşması sırasında miR-124a’nın NFIB 3’UTR’ına bağlanarak NFIB ekspresyonunu kontrol ettiği gösterilmiştir. Yine aynı çalışmada miR-124a’nın NFIB 3’UTR’ındaki iki potansiyel bağlanma bölgesine de bağlandığı (214-418 bp ve 1481-1487 bp) tespit edilmiştir. Bunun aksine, bizim çalışmamızın sonucunda bu bağlanma bölgelerinden sadece birine (1481-1487 bp) fonksiyonel olarak bağlandığı gözlemlenmiştir. Ayrıca çalışmamızla eş zamanlı olarak gerçekleştirilen farklı bir araştırma sonucuna göre, etanole maruz kalınması durumda miR-153 ekspresyonunun arttığı ve nöronal farklılaşmanın daha erken gerçekleştiği görülmüştür. Yine aynı araştırmada miR-153’ün NFIB 3’UTR’ında bulunan iki potansiyel bağlanma bölgesinden birisine (6418-6425 bp) bağlandığı bulunmuştur ve bu bulgular bu tezin sonuçlarını desteklemektedir. Çalışmalarımız sonucunda insan nöral kök hücrelerinin farklılaşması sırasında NFIB ekspresyonu azalırken miR-153 ifadesinin arttığı gözlemlenmiştir. Son olarak yayınlanan başka bir çalışmada ise erken nörogenezde miR-153 ekspresyonunun dışsal etmenlerin (LIF, BMP2) etkisi ile arttığı ve NFIB ekspresyonunu baskıladığı görülürken, geç nörogenez sürecinde ise miR-153 ekspresyonunun azaldığı ve NFIB ekspresyonunun arttığı gözlemlenmiştir. Bunun sonucunda gliogenez ile ilişkili genlerin ifadesinin arttığı tespit edilmiştir. Bu çalışmalarda elde edilen verilerin, bu tezde sunulan bulgular ile tutarlı olması, insan nöral kök hücre hattında gerçekleştiğimiz farklılaşmanın erken nörogenez sürecine örnek oluşturabileceğini göstermektedir.

The transcription factors of the nuclear factor one (NFI) family play an important role in regulation of gene expression during nervous system development. NFI family has four members (NFIA, NFIB, NFIC and NFIX) that are highly homologous in their N-terminal DNA binding domains, but vary in their C terminal transcription activation/repression domains. NFIs can induce or repress transcription of different genes in different cell types in a context dependent manner. Each NFI member has multiple alternative splicing isoforms; however, functions of these isoforms of NFIs have not been well described. NFI proteins recognize consensus sequence TTGGC(N5)GCCAA and bind double strand DNA as homo- or heterodimers. In addition, the post-translational modifications (glycosylation or phosphorylation) of NFI proteins can potentially affect or modulate their function. NFIs are expressed in an overlapping but distinct expression pattern in the developing embryo suggesting a role in regulation of development. All NFIs except for NFIC are expressed in the embryonic central nervous system while expression is restricted to stem cell niches in the adult brain. Deletion of NFIA, NFIB and NFIX leads to distinct phenotypes involving different brain regions such as neocortex, hippocampus, and hindbrain, altering different developmental processes like axonal outgrowth and guidance, differentiation, neurogenesis or gliogenesis. Previously, we have found that while all three neural NFI proteins are expressed in the precerebellar systems of the hindbrain, only the absence of NFIB lead to a delay in the development of precerebellar nuclei. To understand how NFIB affected neurogenesis in the precerebellar system, potential NFIB target genes were identified in precerebellar neuroprogenitors by mRNA expression profiling. Here, we set out to study regulation of downstream targets of NFIB as well as upstream regulators of NFIB in the human neural stem cell culture system derived from H9 human embryonic stem cell line. To this end, we first characterized the expression of NFI family members and three target genes (CDO, COL2A1 and FGF19) selected according to their expression patterns and known functions. Expression of NFIB, NFIC, NFIX, CDO and COL2A1 was significantly reduced while NFIA and FGF19 were up-regulated during neuronal differentiation. NFIB-4, NFIB-3 and/or NFIB-1 isoform mRNA expression was detected in this cell line. We found that NFIB-3 and NFIB-1 protein expression also decreased in differentiated hNSCs. To identify novel upstream regulators of NFIB, we first determined miRNA binding sites on the NFIB 3’UTR and looked for those miRNAs that are upregulated in hNSCs during neural differentiation. We analyzed expression of miR-153, miR-30a, miR-124a, miR-92b, miR-130a and miR-363 and found miR-153, miR-124a and miR-30a expression increased while miR-363 decreased in differentiating hNSCs. Upregulated miRNAs were selected for further study. 3’UTR fragments carrying binding sites of these miRNAs were fused to a reporter gene and screened for inhibition by miRNA mimics. Preliminary data indicate that miR-153 and miR-124a can directly repress translation of NFIB by interacting with 3’UTR_D (6418-6425) and 3’UTR_B (1842-1848) regions on the NFIB. Site directed mutagenesis of miR-153 and miR-124a binding sites appear to render these sites resistant to miRNA mimics, underlining the specificity of this repression.